BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG TCCA
TRICHLOROISOCYANURIC ACID TRONG
KHỬ TRÙNG HẠT GIỐNG SÂM HÀN
QUỐC PANAX GINSENG C.A MEYER, HẠT
VÀ CHỒI CÂY THANH MAI
MYRACA ESCULENTA TRONG INVITRO


DANH MỤC BẢNG, BIỂU ĐỒ
Bảng:
Bảng 1. Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt sâm không lột vỏ....... 31
Bảng 2. Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt sâm không lột vỏ....... 34
Bảng 3. Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt thanh mai đực xử lý
bằng TCCA ....................................................................................................... 41
Bảng 4. Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt thanh mai đực xử lý
bằng Javen ........................................................................................................ 43
Bảng 5. Tỷ lệ số hạt thanh mai nứt rễ ................................................................. 45
Bảng 6. Tỷ lệ nhiễm nấm của chồi thanh mai ...................................................... 48
Biểu đồ:

Biểu đồ 1. Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt sâm không lột
vỏ ..................................................................................................................... 32
Biểu đồ 2. Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt sâm không lột
vỏ ..................................................................................................................... 34
Biểu đồ 3. Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt thanh mai đực
xử lý bằng TCCA ............................................................................................ 42
Biểu đồ 4. Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt thanh mai đực
xử lý bằng Javen .............................................................................................. 43
Biểu đồ 5. Tỷ lệ số hạt thanh mai nứt rễ ........................................................ 46

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1. Quá trình nghiên cứu về hạ sâm ................................................................ 15
Sơ đồ 2. Quá trình nghiên cứu về hạt thanh mai:..................................................... 16
Sơ đồ 3. Quá trình nghiên cứu về chồi thanh mai .................................................... 17


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1. Nhân sâm Panax Ginseng C.A Meyer................................................ 4
Hình 2. Cây thanh mai .................................................................................... 7
Hình 3. TCCA ................................................................................................. 12
Hình 4. Pha xà phịng rồi bỏ hạt vào lắc trong 30 phút .................................. 18
Hình 5. Lựa lịch thước hạt thanh mai ............................................................. 19
Hình 6. Lựa lịch thước hạt thanh mai ............................................................. 19
Hình 7. Quả thanh mai .................................................................................... 20
Hình 8. Quả thanh mai .................................................................................... 20
Hình 9. Ngâm mẫu hạt thanh mai ................................................................... 21
Hình 10. Chồi thanh mai ................................................................................. 21
Hình 11. Lắc hạt thanh mai qua TCCA và JAVEN ........................................ 22
Hình 12. TCCA ............................................................................................... 23
Hình 13. Mơi trường MS................................................................................. 25
Hình 14. Lắc mẫu ............................................................................................ 25
Hình 15. Mơi trường 1/2 MS .......................................................................... 27
Hình 16. Mẫu được lắc qua TCCA ................................................................. 28
Hình 17. Mẫu bị nhiễm nấm ........................................................................... 30
Hình 18.Mẫu bị nhiễm khuẩn.......................................................................... 31
Hình 19. Mẫu bị nhiễm nấm ........................................................................... 33
Hình 20. Mẫu sâm bị khuẩn ............................................................................ 33
Hình 21. Mẫu hạt thanh mai bị phenol hóa ..................................................... 44
Hình 22 . Mẫu hạt thanh mai nhô ra rễ ........................................................... 45



MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................... 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................... 1
1.2. Mục đích của đề tài ........................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4
1.1.1. Sơ lược về đối tượng nghiên cứu ............................................................... 4
1.1.2. Tổng quan về môi trường dinh dưỡng........................................................ 9
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mô đố với hạt sâm Hàn
Quốc, hạt cây thanh mai trong invitro: ................................................................. 9
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước..................................................... 11
1.2.1. Cây Sâm Hàn Quốc .................................................................................. 11
1.2.2. Cây thanh mai:.......................................................................................... 11
1.3. Tổng quan về TTCA ....................................................................................... 12
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁT NGHIÊN CỨU ..................... 14
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu hạt sâm: .................................................... 14
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu hạt cây thanh mai: .................................... 14
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu chồi thanh mai: ........................................ 14
2.3.1. Các nội dung nghiên cứu về hạt sâm:....................................................... 14
2.3.2. Các nội dung nghiên cứu về hạt thanh mai: ............................................. 14
2.3.3. Các nội dung nghiên cứu về chồi thanh mai: ........................................... 14
2.3.4. Đối tượng nghiên cứu về hạt sâm: ........................................................... 15
2.3.5. Đối tượng nghiên cứu hạt thanh mai ....................................................... 16
2.3.6. Đối tượng nghiên cứu:.............................................................................. 17
2.4. Nội dung nghiên cứu: .................................................................................... 23
2.4.1. Pha TCCA với các nồng độ khác nhau để khử mẫu hạt sâm Hàn quốc... 23
2.4.2. Môi trường nuôi cấy hạt sâm Hàn Quốc: ................................................. 24
2.5. Nội dung nghiên cứu hạt thanh mai ................................................................ 26

2.5.1. Môi trường nuôi cấy hạt thanh mai .......................................................... 26
2.5.2. Thao tác thực hiện cấy hạt thanh mai: ...................................................... 27
2.6. Nội dung nghiên cứu: ..................................................................................... 29
KẾT QUẢ NUÔI CẤY HẠT SÂM: ..................................................................... 30
KẾT QUẢ NUÔI CẤY HẠT THANH MAI: ...................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 52


ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Sâm Hàn Quốc (panax ginsieng c.a meyer) Ngày nay như chúng ta đã biết
cuộc sống của con người khơng cịn lo ăn no mặc ấm nữa mà ngày nay con người
luôn hướng đến ăn ngon mặc đẹp và điều đặc biệt là coi trọng vấn đề sức khỏe hơn
nhiều vì vậy những thực phẩm có lợi cho sức khỏe ngày càng được phổ biến một
trong những loại thực phẩm phổ biến thì phải nói đến nhân sâm. Nhân sâm khơng
cịn là thực phẩm quá xa xỉ. đối với mọi người Chỉ bỏ ra một số tiền là bạn có thể sử
dụng loại thần dược này rồi. Trong các loại nhân sâm, thì nhân sâm Hàn Quốc là
phổ biến và có tác dụng tốt nhất.
Nhân sâm Hàn Quốc có tên khoa học Panax Ginseng C.A. Meyer thuộc họ
Araliaceae là một loài thảo dược quý hiếm và rất khó trồng. Trong tự nhiên, nhân
sâm phải trải qua thời gian sinh trưởng kéo dài mới cho phẩm chất thu hoạch tốt,
đặc biệt là hàm lượng Saponin triterpen tích lũy trong các cơ quan bộ phận của cây.
Người ta đã đưa nhân sâm vào trong canh tác truyền thống để sản xuất với số lượng
lớn. Tuy nhiên, việc sản xuất trên môi trường đất trồng nông nghiệp phải trải qua
chu kỳ sản xuất dài (5-7 năm) mới đáp ứng các yêu cầu về chất lượng cho thu hoạch
và sự sinh trưởng của nhân sâm phụ thuộc vào nhiều yếu tố mơi trường bên ngồi
như đất, khí hậu, mầm bệnh và sâu bệnh (Theo Hosakatte Niranjana Murthy và ctg,
2014). Việc sử dụng tế bào và cơ quan ni cấy đã được tìm kiếm như một giải
pháp thay thế tiềm năng để sản xuất hiệu quả các hợp chất thứ cấp từ nhân sâm. Các
bài nghiên cứu chủ yếu các nhà nghiên cứu nghiên cứu về nghiên cứu ni cấy tế

bào và rễ của nhân sâm để tích lũy sinh khối và hàm lượng saponin trong các lò
phản ứng sinh học (Bioreactor) quy mô lớn đã được tiến hành. Kết quả nghiên cứu
và thử nghiệm tại CBN Biotech Company, South Korea cho thấy khi trồng trong các
lò phản ứng sinh học, rễ sâm sinh trưởng nhanh, tích lũy hàm lượng các chất thứ
cấp cao trong thời gian ngắn hơn so với khi trồng theo phương thức truyền thống và
trong tự nhiên (Theo Hosakatte Niranjana Murthy và ctg, 2014).
Chưa thấy một bài nghiên cứu nào đề cập đến việc nuôi cấy hạt nhân sâm Hàn
Quốc để nhân giống tạo thành cây hoàn chỉnh đã và đang được thực hiện trong ni
cấy Invitro. Vì vậy chúng ta cần nghiên cứu nhân giống sâm Hàn Quốc này bằng
hạt sâm.
1


Việt Nam đang từng bước nghiên cứu giải pháp đầu tư phát triển cho ngành
công nghiệp dược phẩm và xuất khẩu với việc đưa nhân sâm thành cây trồng chính
tại các vùng núi cao có khí hậu mát mẻ như Đà Lạt, Sapa, Tam Đảo,… Tận dụng
lợi thế về khí hậu, thổ nhưỡng để phát triển nhân sâm theo hướng sản xuất hàng hóa
và tạo vùng nguyên liệu. Việc nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi trồng
nhân sâm trong nuôi cấy Invitro đang được chú trọng phát triển để đáp ứng nhu cầu
sản xuất thương mại. Tuy nhiên, các tài liệu nghiên cứu về phát triển một môi
trường dinh dưỡng phù hợp cho hạt nhân sâm để sinh trưởng và phát triển tốt hiện
nay vẫn chưa được đề cập đến vì vậy việc nghiên cứu và nhân giống hạt sâm trong
Invitro là một nghiên cứu có vai trị quan trọng trong việc sản xuất nhân sâm sau
này để đáp nhu cầu ngày càng cao của con người.
Cây thanh mai là một loại cây hoặc cây bụi lớn có nguồn gốc ở các ngọn đồi
ở phía bắc Ấn Độ và Nepal .
Tên phổ biến bao gồm hộp myrussy , bayberry và kaphal .
Trong tự nhiên cây thanh mai sinh trưởng và phát triển rất là tốt vì cây thanh
mai này có nguồn gốc là từ cây rừng.
Cây thanh mai được tìm thấy ở các chân đồi của Đơng Hy Mã Lạp Sơn,

Meghalaya, Nepal, Trung Quốc và Pakistan. Địa phương bộ lạc chủ yếu sử dụng
trái cây của nó để chuẩn bị đồ uống dưa chua và giải khát. Ở khu vực Ấn Độ thuộc
dãy núi Himalaya (IHR), hơn 675 phù du hoang dã được biết đến trong đó Myrica
esculenta thường được biết đến với tên gọi là Kaphal ", là một trong những loại trái
cây hoang dã có giá trị cao, cao từ 900 đến 2100 m so với mực nước biển. Các lồi
phân bố từ Ravi về phía đơng đến Assam, Khasi, Jaintia, Naga và đồi Lushi và kéo
dài đến Malaya, Singapore, Trung Quốc và Nhật Bản.
Nó được người dân địa phương ưa chuộng vì các loại trái cây và sản phẩm chế
biến thơm ngon. Loài này rất giống với Myrica rubra, thường thấy ở Trung Quốc
và Nhật Bản.
Những quả chín của hạt thanh mai (M. esculenta ) được thu thập trong tháng 5
năm 2008, từ những quần thể hoang dã nằm ở xa (tức là Kalika (1775), Ayarpani
(1950), Panuwanaula (1800), Jalna (1925), Dholichina (1950), Khirshu (1950)
1650), Shyamkhet (1975), Gwaldom (1925) và Doonagiri (2100 m asl)) ở
Uttarakhand, Ấn Độ. Ngay sau khi thu thập, quả được đưa đến phòng thí nghiệm và
2


giữ trong tủ đông ở nhiệt độ4 ° C. Các mẫu chứng từ của các lồi đã được gửi trong
phịng mẫu của Viện Môi trường và Phát triển Hy Lạp G. B. Pant, Kosi-Katarmal,
Almora để bảo quản hạt giống cho các nghiên cứu sau này.
Ở nước ta thì cây thanh mai được phát hiện tại một số tỉnh miền Trung. Tây
Nguyên.Nhưng nhiều nhất là Quảng Ninh. Tại các huyện đảo của Quảng Ninh.
thanh mai mọc rải rác khắp các đảo đá từ gần bờ, đến xa bờ.
Ngày nay do giao đất giao rừng trồng cây lấy gỗ. Diện tích đất rừng tự nhiên
bị thu hẹp. Cây thanh mai và nhiều loại cây rừng khác bị thay thế bởi cỏ lau và cây
cơng nghiệp.
Bên cạnh đó những năm gần đây, do thanh mai được ưa chuộng. Nên vấn đề
tìm kiếm giống, trồng thử nghiệm nuôi cấy trong INVITRO để nhân giống rộng rãi
đáp ứng nhu cầu của con người và đồng thời đánh giá phạm vi biến đổi của các chất

chống oxy hóa có trong hạt thanh mai bằng cách sử dụng các phương pháp khác
nhau trong INVITRO và xác định nguồn gốc thành phần bên trong hạt thanh mai
này là trái cây tốt có lợi cho sức khỏe con người.
1.2. Mục đích của đề tài
1.2.1. Sâm Hàn Quốc
Xác định nồng độ TCCA khử trùng nào thích hợp cho ni cấy hạt nhân sâm
trong Invitro.
Xem xét môi trường MS
1.2.2. Cây thanh mai
Xác định nồng độ TCCA khử trùng nào thích hợp cho nuôi cấy hạt và chồi cây
thanh mai trong Invitro.
Xác định môi trường dinh dưỡng phù hợp cho nuôi cấy hạt và chồi cây thanh
mai trong Invitro.

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan tài liệu
1.1.1. Sơ lược về đối tượng nghiên cứu
1.1.1.1. Sơ lược về nhân sâm Panax Ginseng C.A Meyer

Hình 1. Nhân sâm Panax Ginseng C.A Meyer
Nhân sâm Panax Ginseng C.A Meyer thuộc họ Araliaceae là một loại cây thảo
dược có dược tính cao, có ý nghĩa to lớn trong y học, các giá trị dược liệu đã được
các nhà khoa học nghiên cứu và chứng minh trong nhiều năm qua. Nó được sử dụng
phổ biến ở các nơi khác trên thế giới đặc biệt là ở Bắc Mỹ và châu Âu như là một
loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao. Thường được trồng ở các vùng phía đơng
của Châu Á, đặc biệt nhiều ở Hàn Quốc. Rễ của cây nhân sâm Hàn Quốc nhìn hơi
giống hình người. Ở những vùng đất có điều kiện khí hậu, đất đai khác nhau sẽ cho

ra chất lượng Sâm khác nhau.
Nhân sâm trồng ở các vùng núi có chất lượng khác hẳn ở những vùng
khác.Các nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng, điều kiện khí hậu, mơi trường và đất
đai ở Hàn Quốc giúp cho nhân sâm có điều kiện phát triển tốt nhất.Chính vì vậy mà
trong các chủng loại sâm trên thế giới thì Nhân sâm Hàn Quốc có chất lượng hơn
hẳn.Và hình dáng nhân sâm Hàn Quốc cũng giống người hơn hẳn so với các loại
nhân sâm cùng loại.
Các thành phần chính của nhân sâm là saponin triterpenoid, được gọi là
ginsenosides. Ginsenosides được chia thành ba nhóm dựa trên cấu trúc của chúng,
4


tức là nhóm Rb (protopanaxadiols bao gồm Rb1, Rb2, Rc và Rd, vv), nhóm Rg
(protopanaxatriols bao gồm Rg1, Re, Rf, và Rg2, vv) và Ro nhóm (axit Olenolic).
Ngồi ra, Trong củ, thân và rễ chứa 32 thành phần soponin triterpen, trong đó thành
phần hoạt chất có tác dụng sinh học chủ yếu của sâm có 30 chất là saponin
dammaran.
Ở thân rễ của Nhân Sâm mọc hoang chứa rất cao hàm lượng saponin, chứa
đến 10,75%. Ngồi ra cịn có những hợp chất khác như: 17 axit béo trong đó có axit
palmitic, stearic, oleic, linoleic và linolenic, 17 loại axit amin trong đó có đủ 8 loại
axit amin cần thiết cho cơ thể, 20 nguyên tố vi lượng trong đó có Co, Se, K, Fe, Mn
và các loại vitamin A, B1, B2, C.Các thành phần khác là tinh dầu, glucid. Trong
thân của rễ Nhân Sâm tươi có thành phần daucosterol. Ngồi ra, do hấp và sấy ở
nhiệt độ cao, làm xuất hiện thêm nhiều thành phần khác như Maltol, chất làm giảm
quá trình lão hóa, Ginsenoside Rg3, chất ngăn sự tái phát tế bào ung thư di căn và
sự phát triển tế bào ung thư mới, hợp phần chất chống ung thư, Ginsenoside RH2,
chất làm giảm ức chế sự phát triển tế bào ung thư. (Theo Park Jong Dae và ctg,
2005). Rễ Có một hệ thống rễ trong đó bao gồm đầu thân rễ, rễ chính và rễ phụ mà
từ đó rất nhiều rễ tốt và lông rễ phát triển. Trong quá trình phát triển rễ thì hình
dạng của nhân sâm Hàn Quốc cũng có nhiều chuyển đổi. Ở năm đầu tiên gieo trồng,

rễ nhân sâm sẽ trải qua quá trình rễ kéo dài (khoảng từ 4 – 6 tháng) và quá trình rễ
to (khoảng từ 7 – 9 tháng) để trở thành một cây con mang củ. Trong năm thứ hai rễ
bên mới bắt đầu phát triển, và chiều dài của rễ chính và số rễ phụ được hình thành
trong năm thứ ba gieo trồng. Lá sâm có phần cuống dài. Cuống lá nhân sâm 5-6
năm tuổi thường có 5 lá, có 2-3 lá kép nhỏ bên cạnh lá phớt chính. Đầu lá nhọn và
phần rìa lá có nhiều răng cưa. Hoa nhân sâm bắt đầu nở khi cây nhân sâm được 3
tuổi, hoa có màu trắng, hoa nhân sâm nở to nhất vào tháng 5. Quả nhân sâm mọng,
ban đầu có màu xanh lá cây, rồi chuyển thành màu đỏ khi chín. Quả nhân sâm 3
năm tuổi thường bỏ đi vì khơng có giá trị, người ta chỉ thường thu hoạch quả nhân
sâm 5-6 năm tuổi về và sấy khô để làm hạt giống cho vụ sau.
Cây nhân sâm được thu thập từ môi trường sống tự nhiên rất đắt và trở thành
loại hàng hóa khan hiếm. Tại Hàn Quốc, người ta đã đưa nhân sâm vào trong canh
tác nông nghiệp. Những tiến bộ hiện tại trong công nghệ sinh học thực vật đã giúp
chúng ta có thể ni cấy tế bào cũng như rễ nhân sâm để sản xuất các chất thứ cấp
5


trong thời gian nhanh hơn và ít tốn cơng sức hơn. Năng suất trung bình của nhân
sâm Panax ginseng C. A. Meyer từ trồng trọt ở Hàn Quốc là 523 kg / 0,1 ha, trong
khi đó, năng suất sinh khối của rễ nhân sâm được trồng trong 4.000 lít bioreactors
trong 45 ngày và hoạt động trong 7-8 chu kỳ trong 1 năm (được thực hiện bởi CBN
Biotech, Cheongju, Hàn Quốc) là khoảng 30.000 kg (Theo Hosakatte Niranjana
Murthy và ctg, 2014).
Hiện nay nhân sâm Hàn Quốc được phân theo hai phương pháp:
Phân loại nhân sâm theo phương pháp chế biến và Phân loại nhân sâm theo
q trình sinh trưởng, mơi trường sinh trưởng.
Trong hàng nghìn năm lịch sử. Người Hàn Quốc cổ đại và những người thổ
dân bản xứ vùng Bắc Mỹ coi nhân sâm là thảo dược quý, được đánh giá cao nhất
của tất cả các loại thảo dược chữa bệnh là một trong những dược liệu thiên nhiên
quý hiếm và rất có giá trị. Nó có vị đắng, khơng độc, có tác dụng đại bổ ngun khí,

bồi bổ sức khỏe, năng cao thể lực cho cơ thể. Một số công dụng của nhân sâm hàn
quốc như: Tăng cường sức khỏe, bồi bổ cơ thể, Giải độc gan, tăng cường chức năng
gan, tăng cường chức năng hệ tuần hoàn, tăng cường chức năng hệ tuần hoàn Làm
đẹp da, giữ dáng cho phụ nữ, tăng khả năng giảm mệt mỏi, tăng khả năng tư duy và
thể lực.
Ngày nay, để đa dạng hóa các sản phẩm nhân sâm Hàn Quốc trên thị trường,
người ta có thể chế biến thành nhiều sản phẩm đa dạng khác nhau như: Rượu nhân
sâm, kẹo nhân sâm…
Trên thế giới, lĩnh vực nhân sâm không những chỉ thu hút các nhà kinh doanh
mà còn các nhà khoa học, nghiên cứu sinh. Theo xu hướng hiện nay các sản phẩm
nhân sâm từ nguyên liệu mới hoặc bổ sung thêm các ngun liệu có dược tính tốt
(atiso, chế phẩm probiotic, …) rất được quan tâm.

6


1.1.1.2. Sơ lược về cây thanh mai:

Hình 2. Cây thanh mai
Cây thanh mai thuộc loại cây rừng. Myrica esculenta (Myricaceae) thường
được gọi là hộp berry hoặc kaphal là một loại thuốc quan trọng của Ấn Độ
Trái cây Myrica esculenta, một loài ăn được hoang dã của Vùng Hy Mã Lạp
Sơn, được đánh giá về các hợp chất phenolic và đặc tính chống oxy hóa.
Chi Myrica bao gồm khoảng 97 lồi cây nhỏ và cây bụi thơm thuộc họ
Myricaceae.
Chúng được báo cáo là được phân phối trên toàn cầu ở cả hai vùng ôn đới và
cận nhiệt đới trên thế giới. Chỉ có một lồi Myrica australiasica F.Muell, đã được
báo cáo ở Úc, trong khi M. cerifera L. (Wax myrussy / Nam sáp myrussy) và M.
Persylvanica Mirb. (Bayberry miền Bắc) được báo cáo là thuốc chính thức của Bắc
Mỹ và tuyên bố có cùng tính chất dược liệu ở đó, như M. esculenta trong các hệ

thống y học Ấn Độ. Các một loài khác thuộc chi Myrica, chẳng hạn như M. rubra
được gọi là bayberry Trung Quốc thường được tìm thấy trong Trung Quốc và Nhật
Bản. Một số loài khác, mà Thuộc chi Myrica là M. adenophora hance, M.
caroliniesis (thường xanh bayberry).
Nó là một kinh tế cây thuốc có cơng dụng đa năng. Là Actinorhizal, nó cũng
hữu ích trong việc tái tạo nitơ đất cạn kiệt. Nhà máy chủ yếu có nguồn gốc cho trái
cây, một trong những loại trái cây hoang dã ngon nhất của khu vực cận Hy Lạp và
đã được công nhận tiềm năng dinh dưỡng và trị liệu.
Trái cây của cây cũng được sử dụng để chuẩn bị mứt, xi-rô, làm mới đồ uống
và dưa chua. Đây là nguồn vitamin phong phú Các hợp chất C và polyphenolic như
7


tannin,phenol, flavonoid và flavonol, có thể sử dụng cây làm gỗ, nhiên liệu, thức ăn
gia súc, gỗ .Mặc dù là một cây đa năng, việc trồng trọt của nhà máy rất hạn chế và
hầu hết các truyền thống và sử dụng thương mại của cây M. esculenta phụ thuộc
độc quyền trên các bộ sưu tập từ các nguồn hoang dã bởi người bản địa . Do đó, các
lồi là dưới nguy cơ tuyệt chủng sắp xảy ra từ các nguồn hoang dã gia tăng đơ thị
hóa, thu hoạch q mức, sơ suất sử dụng bền vững và khai thác quá mức rừng và
đất hoang để sử dụng thương mại. Nghèo nàn tái sinh trong môi trường sống tự
nhiên do nhân tạo cao hoạt động là một yếu tố quan trọng khác, ảnh hưởng đến
quần thể tự nhiên của loài thực vật này. Các sử dụng ethnomedical, hóa học và điều
trị tiềm năng của M. esculenta cho triển vọng tương lai của nó như vậy bảo tồn,
canh tác và sử dụng bền vững cũng như để nhận ra tính chất dược liệu này nhà máy
trong hệ thống y học hiện đại.
Cây thanh mai lá có rìa tồn bộ hoặc răng cưa, hoa nhụy hoa nhỏ, khơng có
gai, đơn độc và có xương sống, dài 4,2 cm, nách lá, mang khoảng 25 bơng hoa theo
kiểu giống như sợi chỉ. Quả thì hình elip hoặc hình bầu dục và đường kính khoảng
2-7 mm, vị ngọt và chua, mọng nước, màu xanh nhạt chuyển sang màu đỏ đậm khi
chín và có đường kính khoảng 1 - 2 cm. Hạt có hình tam giác và có vị trong.

Vịng đời Ra hoa: Tháng 5-9. Cây ra quả: Tháng Hai-Tháng Tư.
Chu kỳ Hoa nở trong suốt tháng mười đến tháng mười hai. Trái cây tháng Tư
đến tháng Sáu. Kích thước: Cây cao khoảng 12-15 m với đường kính thân khoảng
92,5 cm
Trong tự nhiên cây thanh mai có cây Đực và cây Cái.
Hạt thanh mai có thể mất 2-12 tháng để nảy mầm tùy thuộc vào thời gian các
lớp sáp trên hạt bị phá vỡ. Để kích thích hạt nảy mầm nhanh nhất, bạn có thể cạo bỏ
một phần lớp sáp bao quanh hạt bằng cách chà xát lớp vỏ trên bề mặt nhám trước
khi gieo.
Cây thanh mai có nhiều thành phần dinh dưỡng và cơng dụng rất tuyệt vời
trong quả xanh có axit hữu cơ, tanin, vitamin C, quả chín chứa đường, sắc tố
anthoxyan. loại quả này chứa 7-10% đường, 0,5-1% axit hữu cơ và rất ít myrixetin.
Lá chứa 0,02-0,03% tinh dầu, tanin và taraxerol. Trái cây của nó giàu hơn về giá trị
dinh dưỡng với 13,90% tổng chất rắn hòa tan,1,52% axit, 7,26% tổng lượng đường
và 9,05 mg / 100 ml vitamin C (Rawat, 2007) và hàm lượng protein cao. Loài này
8


cũng được sử dụng làm củi, một nguồn sắc tố cho chết, cũng như để làm nông cụ và
các dụng cụ gia đình khác nhau ở nơng thơn những người. Hoa có giá trị dược liệu
và được sử dụng như một loại thuốc bổ và để điều trị đau tai, tiêu chảy và tê liệt.
Cách sử dụng truyền thống của (M. esculenta) đã truyền cảm hứng cho các
nhà nghiên cứu để xác minh tiện ích của nó thơng qua khoa học sàng lọc dược lý.
Một số chiết xuất thô từ các bộ phận khác nhau của cây và hoạt tính sinh học bị cô
lập các hợp chất đã được đánh giá cho sinh học khác nhau, các hoạt động như giảm
đau, chống hen, chống ung thư, chất chống oxy hóa, chống viêm, trị đái tháo đường,
chống loét, giải lo âu, bảo vệ gan, hóa trị.
1.1.2. Tổng quan về mơi trường dinh dưỡng
Môi trường Murashige-Skoog (MS) là một trong những loại môi trường được
sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mơ và tế bào thực vật. Mơi trường MS thích

hợp cho cả thực hai lá mầm và một lá mầm. Có rất nhiều mơi trường MS cải tiến
trên cơ sở công thức gốc do Murashige và Skoog công bố năm 1962 như mơi
trường B5, LS, WP,… Mơi trường MS ½ là mơi trường MS cải tiến giảm ½ các
chất khống đa lượng so với môi trường MS ban đầu (Giáo trình Cơng nghệ ni
cấy mơ tế bào thực vật, Trường Đại học Đà Lạt, 2014).
Thành phần hóa học của mơi trường đóng vai trị quan trọng đối với thành
cơng của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi loại cây, mỗi kiểu gen hay các kiểu
nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào, tế bào trần, bao phấn, hạt
phấn, rễ cây,…) đều có những địi hỏi khác nhau về thành phần môi trường. Trong
môi trường dinh dưỡng, các chất điều hịa sinh trưởng đóng vai trị quan trọng đối
với phát sinh hình thái, phân chia và phân hóa tế bào, hình thành mơ cơ quan như
phát sinh chồi và tạo rễ. Việc thay đổi nồng độ các chất khống trong mơi trường
cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc điều khiển các giai đoạn phát trển khác
nhau của q trình ni cấy.
Trên cơ sở đó, trong nghiên cứu này, mơi trường MS và MS ½ có bổ sung
IBA ở nồng độ 0,5mg BA/ lít sử dụng để nghiên cứu sự tăng trưởng và phát triển
của hạt nhân sâm Panax Ginseng C.A Meyer trong Invitro.

9


1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mô đố với hạt sâm Hàn
Quốc, hạt cây thanh mai trong invitro:
Ảnh hưởng môi trường: môi trường ms cơ bản có bổ sung các chất điều hịa
sinh trưởng ở nồng độ thích hợp cho tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh nhất của
mẫu.
Trạng thái vật lý của môi trường có ý nghĩa quan trọng trong ni cấy
invitro. Đa số sử dụng mơi trường Agar như các chất khí thành phần chất khí trong
bịch ni cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây Invitro như oxi, CO2, Ethylene.
Quá trình quang hợp xảy ra nhanh hơn khi có nhiều khí CO2 và cường độ ánh

sáng cao đồng thời nâng cao tốc độ vi nhân giống. CO2 có thể bị giới hạn trong
bình ni cấy và sử dụng nắp bình có lỗ thơng khí.
Oxi có giới hạn trong ni cấy mô.
Hormon Tầm quan trọng của việc sử dụng Auxin và Cytokinin trong hệ thống
vi nhân giống.
Các yếu tố vật lý như nhiệt độ ,nhiệt độ thích hợp ni cấy mơ 20- 27 độ c.
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển cây Invitro qua những tiến trình
sinh lý như hơ hấp hay hình thành tế bào và cơ quan.
Ánh sáng cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp ảnh
hưởng đến khả năng nuôi cấy invitro cây có lá xanh, cường độ ánh sáng cao hay
thấp cũng ảnh hưởng đến sự tăng sinh chồi. ánh sáng thích hợp ni cấy ánh sáng
huỳnh quang trắng có cường độ 2000 Lux.
Mẫu đưa vào ni cấy bị hoại mẫu có hai tác nhân làm hư hoại mẫu như Bị
virus xâm nhiễm khơng hoại mẫu nhưng có ảnh hưởng về sau. Để giảm virus nên sử
dụng mẫu nuôi cấy là nhu mô phân sinh đỉnh.
Bị vi sinh vật xâm nhiễm như: Agrobacterium, bacillus, erwinia vào nhu mô
sẽ dẫn truyền sự hoại mẫu khi tế bào bắt đầu phân chia, có thể khử trùng mẫu trước
khi cấy vào mơi trường.
Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy như hiện tượng mẫu bị hóa nâu
nguyên nhân là do mẫu ni cấy có chứa nhiều tannin hay hidroxyphenol có nhiều
trong mơ. Một số phương pháp giảm sự nâu hóa như đưa vào mơi trường mới.
Mẫu chuẩn bị cấy có vết cắt nhỏ, để ngoài vài giờ trước khi cấy, hay nơi cấy
trong môi trường không cố ánh sáng.
10


1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước
1.2.1. Cây Sâm Hàn Quốc
1.2.1.1. Những nghiên cứu ngoài nước
Năm 1983, Furuya và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của auxin đến sự

tăng trưởng và tích lũy saponin trong tế bào mô sẹo của nhân sâm Panax ginseng
C.A Meyer. Kết quả cho thấy rằng, nuôi callus trên môi trường MS có bổ sung 4.53
µM 2,4-D kích thích sự hình thành và phát triển của callus, cùng với đó, nồng độ
IBA 19.68 µM được cho là phù hợp nhất cho sự hình thành và tăng trưởng của rễ
bất định ni trên mơi trường MS lỏng trong các bioreactor.
Ngồi ra khơng có những tài liệu nước ngoài nào đề cập đến vấn đề nhân
giống Sâm Hàn Quốc bằng hạt.
1.2.1.2. Những nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu khả năng nhân giống cây nhân sâm Panax Ginseng C.A Meyer
bằng phương pháp In vitro đã được tiến hành tại Đại học Nông lâm Thái Nguyên.
Các kết quả của nghiên cứu này đã đưa ra được kỹ thuật nhân giống cây
nhân sâm Panax ginseng C.A. Meyer bằng phương pháp In vitro. Đánh giá
được tác động của một số chất kích thích sinh trưởng trong nhân giống cây
nhân sâm Panax ginseng C.A. Meyer (Dương Thị Liên, 2014).
Những nghiên cứu trong và ngồi nước cung cấp một nguồn thơng tin khoa
học ban đầu cho việc nghiên cứu cây nhân sâm Panax Ginseng C.A Meyer trong
Invitro tại Việt Nam nó chung và Đà Lạt nói riêng.
1.2.2. Cây thanh mai:
1.2.2.1. Những nghiên cứu ngoài nước:
Khoa Khoa học Dược phẩm và Nghiên cứu Dược phẩm, Đại học Punjabi,
Patiala-147 002, Ấn Độ của P. Sood và R. Shr đã cho ta thấy được các khía cạnh về
dược học và vật lý của cây thanh mai.
Hiệu quả bảo vệ trên Myrica esculenta và phương pháp xử lý tiền nảy mầm
đối với hạt thanh mai Y.K. TOMAR VÀ VIDYAWATI RAWAT
Khoa Trồng trọt, Cơ sở Chauras, Đại học HNB Garhwal, Srinagar (Garhwal),
246174, Uttarakhand, Ấn Độ xác định ngâm trong axit sulfuric trong 4, 8 và 12 phút
và ngâm trong nước nóng 24, 48 và 72 giờ. Một số hạt bị sẹo được xử lý với hai
nồng độ GA3: 50 và 100 ppm. Tất cả các tiền xử lý đều cải thiện khả năng nảy mầm
11



của hạt, cao nhất là sau sẹo cơ học với ngâm trong GA3100 ppm (85,00%); nảy
mầm cao nhất tiếp theo là với axit sulfuric và phương pháp điều trị ngâm nước
nóng. Tỷ lệ sống tối đa (60,00%) cây giống được liên kết với 48 giờ ngâm nước
nóng. Thời lượng bắn tối đa (9,50 em) xảy ra với GA3 50 ppm xử lý hạt bị sẹo,
trong khi chiều dài rễ tối đa (14,68 em), số lượng lá (11,50), trọng lượng khô (0,19
g) và trọng lượng khô của rễ (0,26 g) đã được tìm thấy với GA3 100 ppm. Ngâm
trong nước nóng trong 48 giờ là cách điều trị được khuyến cáo là rẻ tiền và dễ dàng
áp dụng vì sự khan hiếm dẫn đến mức độ thiệt hại cao cho hạt giống.
1.3. Tổng quan về TTCA
Thành phần
Tên gọi: Tricholoroisocyanuric acid, TCCA 90% có thành phần chính là Axit
Trichloroisocyanuric 90%
Cơng thức hố học: C3H3N3O3Cl3
Là hố chất mang tính hữu cơ
TCCA là một loại thuốc khử trùng, sát trùng chứa nhóm halogen, là một
thuốc thơng dụng nhất, khi hồ tan trong nước nó hình thành HCLO.

Hình 3. TCCA
Cơng dụng
Tiêu diệt các vi sinh vật, diệt tảo, rong rêu trong nước.
Phòng chống bệnh tật cho gia súc, gia cầm, cá, tôm
Diệt vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng gây bệnh. Phòng ngừa và kiểm soát dịch
bệnh
Diệt trừ nấm mốc, ký sinh trùng và các mùi hơi thối nhanh chóng trên đồ
dùng, máy móc và các thiết bị y tế, chăn màn, quần áo, nhà xưởng…
12


Khử trùng môi trường nơi gần bải rác, vùng lũ lụt, thiên tai…

Khử khuẩn nước sinh hoạt, y tế, cộng đồng.
Làm tăng ôxy trong nước và không làm thay đổi nồng độ pH của nước.
Đóng gói dạng viên nén, có phản ứng sủi từ dưới lên đem lại hiệu quả xử lý
cao, an toàn cho người sử dụng, thân thiện với môi trường
TCCA là một loại thuốc khử trùng, sát trùng chứa nhóm halogen, là một
thuốc thơng dụng nhất, khi hồ tan trong nước nó hình thành HCLO

13


CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁT NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu hạt sâm:
Thời gian: từ ngày 28/12/2018 đến 2/05/2019
Địa điểm: các thí nghiệm trong đề tài được tiến hành tại phịng thí nghiêm của
Viện Nghiên trường Đại học Đà Lạt.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu hạt cây thanh mai:
Thời gian: từ ngày 10/02/2018 đến 2/05/2019
Địa điểm: các thí nghiệm trong đề tài được tiến hành tại phịng thí nghiêm của
Viện Nghiên trường Đại học Đà Lạt.
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu chồi thanh mai:
Thời gian: từ ngày 9/04/2018 đến 2/05/2019
Địa điểm: các thí nghiệm trong đề tài được tiến hành tại phịng thí nghiêm của
Viện Nghiên trường Đại học Đà Lạt.
2.3.1. Các nội dung nghiên cứu về hạt sâm:
Khảo sát nồng độ TCCA khử trùng nào thích hợp cho ni cấy hạt nhân sâm
trong Invitro.
Khảo sát mức độ nhiễm đối với hai mẫu sâm lột vỏ và không lột vỏ
Khảo sát đánh giá các chỉ tiêu của của cây sâm khi lên cây như mẫu nhiễm
nấm, mẫu nhiễm khuẩn, mẫu sạch, chiều cao cây, trọng lượng tươi của cây.
2.3.2. Các nội dung nghiên cứu về hạt thanh mai:

So sánh giữa chất khử trùng TCCA và Javen chất khử trùng nài đem lại hiệu
quả cao hơn
Khảo sát đánh giá các chỉ tiêu của của cây thanh mai khi lên cây như mẫu
nhiễm nấm, mẫu nhiễm khuẩn, mẫu sạch, chiều cao cây, trọng lượng tươi của cây.
2.3.3. Các nội dung nghiên cứu về chồi thanh mai:
Khảo sát nồng độ TCCA khử trùng nào thích hợp cho ni cấy chồi thanh mai
trong Invitro.
So sánh giữa chất khử trùng TCCA và Javen chất khử trùng nài đem lại hiệu
quả cao hơn.
Khảo sát đánh giá các chỉ tiêu của của cây thanh mai khi lên cây như mẫu
nhiễm nấm, mẫu nhiễm khuẩn, mẫu sạch, chiều cao cây, trọng lượng tươi của cây.

14


2.3.4. Đối tượng nghiên cứu về hạt sâm:
Đề tài được tiến hành đối với hạt sâm tại nhà kính khoa nông lâm do đối tác
khoa nông lâm cấp cung cấp và hạt sâm tự hái (hạt chín trên cây sâm) tại nhà kính
khoa nơng lâm tại Trường Đại Học Đà Lạt.
Hạt sâm được đối tác khoa nông lâm cấp đã được ủ và được tách vỏ chuyển
đến phịng thí nghiệm của Viện Nghiên trường Đại học Đà Lạt để tiến hành thí
nghiệm.
Sơ đồ 1. Q trình nghiên cứu về hạ sâm
HẠT SÂM

Lắc

Nhằm khử trùng mẫu để

trong


thu được mẫu sạch lắc

TCCA

mẫu thấy mẫu chuyển

30 phút

màu.

TN2: nồng độ

Rửa lại

Nhằm rửa sạch lại mẫu

TCCA 300mg/l

nước cất 3

TN1: nồng độ
TCCA 200mg/l

để lắc qua cồn

lần

TN3: nồng độ


Lắc qua cồn

Khử trùng mẫu tạo độ

TCCA 400mg/l

70 độ trong 2

sạch hoàn toàn cho mẫu

phút

TN4:

nồng

độ

TCCA 500mg/l

Rửa lại nước
cất 3 lần

TN5: nồng độ

Cấy vào môi

TCCA 600mg/l

trường


Rửa lại sạch cồn để cấy
vào môi trường.

15


2.3.5. Đối tượng nghiên cứu hạt thanh mai
Đề tài được tiến hành đối với hạt cây thanh mai được thu thập mẫu tại rừng
hỗn giao thông và cây thanh mai ở Hồ Tuyền Lâm Thành Phố Đà Lạt.
Sơ đồ 2. Quá trình nghiên cứu về hạt thanh mai:
HẠT THANH MAI
Lắc

trong

TCCA
TN1: đối chứng

JAVEN

thu được mẫu sạch lắc
30

phút

TN2: ngâm hạt trong
nước cất vô trùng 24h

Nhằm khử trùng mẫu để


mẫu thấy mẫu chuyển
màu.

Rửa lại nước
cất 3 lần

Nhằm rửa sạch lại mẫu
để lắc qua cồn

Lắc qua cồn

Khử trùng mẫu tạo độ

TN3: ngâm hạt trong

70 độ trong 2

sạch hồn tồn cho mẫu

nước cất vơ trùng 48h

phút
Rửa lại nước

Rửa lại sạch cồn để cấy

cất 3 lần

vào môi trường.


TN4: ngâm hạt trong
nước cất vô trùng 72h
Cấy vào
môi trường

16


2.3.6. Đối tượng nghiên cứu:
Đề tài được tiến hành đối với chồi cây thanh mai đi thu thập mẫu tại Hồ Tuyền
Lâm.
Sơ đồ 3. Quá trình nghiên cứu về chồi thanh mai
CHỒI THANH MAI

TN1: khử trùng
Nồng độ TCCA 400

Lắc trong

Nhằm khử trùng mẫu để

TCCA

thu được mẫu sạch lắc

JAVEN 30

mẫu thấy mẫu chuyển


phút
Rửa lại
nước cất 3

màu.
Nhằm rửa sạch lại mẫu
để lắc qua cồn

lần
TN2: khử trùng Nồng
độ TCCA 500

Lắc qua cồn

Khử trùng mẫu tạo độ

70 độ trong 2

sạch hoàn toàn cho mẫu

phút
Rửa lại nước
cất 3 lần

rửa lại sạch cồn để cấy
vào môi trường.

TN3: khử trùng Nồng
độ JAVEN 5%
Cấy vào môi

trường

Lựa chọn hạt sâm nguyên liệu
Mục tiêu: Lựa chọn được hạt sâm không bị mốc đen, mang lại hiệu quả cho
quá trình nghiên cứu chọn hạt không bị vỡ trầy xướt.
Thực hiện:
Mẫu hạt sâm gồm 2 loại:
Đối với hạt phơi khô (tự hái): (khơng tách vỏ) đem hạt rửa dưới vịi nước
khoảng 30 phút
17


Pha xà phòng rồi bỏ hạt vào lắc trong 30 phút

Hình 4. Pha xà phịng rồi bỏ hạt vào lắc trong 30 phút
Sau đó xả lại với nước cho sạch xà phịng và cho hạt vào tủ cấy vơ trùng lắc
hạt lại với nước cất vô trùng 3 lần. đối với hạt phơi khô cần 225 hạt (do Gồm 5
nghiệm thức 3 lần lặp, 1 lần lặp có 3 bịch mỗi bịch thì 5 hạt thì suy ra 1 nghiệm
thức 45 hạt, 5 nghiệm thức 225 hạt . )
Kí hiệu: 1.1, 2.1, 3.1,4.1,5.1 trên miệng bịch môi trường.

18


Hình 5. Lựa lịch thước hạt thanh mai
Đối với hạt vỏ đã nứt ra (do MR Kan đối tác khoa nơng lâm cung cấp) thì đem
hạt rửa dưới vịi nước khoảng 30 phút , pha xà phòng rồi bỏ hạt vào lắc trong 30
phút và sau đó xả lại với nước cho sạch xà phịng sau đó lắc cồn 70 độ trong 1 phút
bỏ hạt vào tủ cấyvà tiếp theo lắc hạt trong nước cất vô trùng lại 3 lần..cũng cần 225
hạt như trên.

Kí hiệu: 1, 2, 3, 4, 5. Trên miệng bịch mơi trường

Hình 6. Lựa lịch thước hạt thanh mai
Mỗi trường hợp lấy nhiều hơn 225 hạt để đem đi xử lý mẫu, để tránh hiện
tượng hao hụt mẫu (trong quá trình khử trùng mẫu).
19


Dụng cụ nghiên cứu trong nuôi cấy sâm hàn quốc như: các hóa chất để pha
mơi trường, cân hóa chất, bịch ni long đựng môi trường, tủ cấy, các dụng cụ để đo
lường, định mức…
Lựa chọn hạt thanh mai nguyên liệu
Mục tiêu: Lựa chọn được hạt thanh mai đực được hái ở trên cây ở Hồ Tuyền
Lâm những hạt đã chín có màu đỏ hoặc đỏ sẫm .

Hình 7. Quả thanh mai
Thực hiện xử lý mẫu:
Mẫu hạt thanh mai đực được hái và đem về rửa sạch cạo sạch lớp vỏ thịt bên
ngoài sử dụng giấy nhám để chà vỏ cho đến khi vỏ quả nhẵn khơng cịn lơng, sau
đó đem phơi khoảng 15 phút ngồi nắng.

Hình 8. Quả thanh mai
Tiếp theo đó chuẩn bị 4 lọ thủy tinh để cho hạt vào ngâm trong nước cất vô
trùng mỗi lọ cho vào 40 hạt.

20