Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017

Kỷ yếu khoa học

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ BỆNH PARKINSON CỦA CAO CHIẾT RAU SAM
(PORTULACA OLERACEA L.) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GENE
MANG KIỂU HÌNH BỆNH
Trương Huỳnh Kim Thoa*
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh
*Tác giả liên hệ:
TĨM TẮT
Parkinson là một trong những bệnh thối hóa thần kinh phổ biến với các biểu hiện về rối loạn
vận động và chết tế bào thần kinh sinh dopamine ở vùng chất đen. Các nghiên cứu trước đây
cho thấy, ruồi chuyển gene knockdown duch trên các tế bào thần kinh sinh dopamine biểu
hiện các triệu chứng của bệnh Parkinson bao gồm suy giảm vận động và chết tế bào sinh
dopamine. Các triệu chứng do knockdown duch giảm khi bổ sung thêm hợp chất kháng oxi
hóa như curcumin hay vitamin C. Các kết quả này cho thấy tiềm năng sử dụng mơ hình ruồi
knockdown duch trong sàng lọc chất kháng oxi hóa để điều trị bệnh Parkinson. Trong nghiên
cứu này, chúng tôi sử dụng ruồi knockdown duch nhằm mục đích kiểm tra khả năng sử dụng
cao chiết từ rau sam (Portulaca oleracea L.) để điều trị bệnh Parkinson. Kết quả thực nghiệm
cho thấy cao chiết rau sam cải thiện triệu chứng suy thoái vận động do knockdown duch gây
ra ở ấu trùng ruồi mơ hình và làm chậm tiến trình bệnh ở ruồi trưởng thành. Đồng thời, ở
mức độ tế bào, cao chiết rau sam cải thiện tình trạng thối hóa tế bào thần kinh sản sinh
dopamine gây ra do knockdown duch ở ruồi giấm.
Từ khóa: Bệnh Parkinson, mơ hình ruồi giấm, mơ hình ruồi knock-down duch, kháng oxy
hóa, rau sam.
EFFECT OF PURSLANE EXTRACT (PORTULACA OLERACEA L.) ON
ROSOPHILA MODEL OF PARKINSON’S DISEASE
Truong Huynh Kim Thoa*
University of Science – VNU Ho Chi Minh City
*Corresponding Author:

ABSTRACT
Parkinson’s disease is one of the most common neurodegenerative disoder, which is
characterized by progressive deterioration of motor function and loss of dopaminergic
neurons in the substantia nigra. Previous studies showed that Drosophila which bearing
dopaminergic neuron-specific knockdown of duch manifested PD’s symptoms including
decreases in locomotor abilities and loss of dopaminergic neurons. Noticeably, antioxidants
such as curcumin and vitamin C improved these PD symptoms in the fly model. These results
demonstrated that duch-knockdown flies is a potential model for screening antioxidants which
can be used for PD treatment. In this study, we utilized duch-knockdown flies in order to
evaluate capacity of purslane (Portulaca oleracea L.) extract in using for PD treatment. The
results showed that purslane extract could improve the locomotor abilities in the larval stage
and decelerate disease’s progression in the adult stage. Additionally, in cellular base,
purslane extract could reduce DA neuron degeneration caused by knockdown of duch.
Keywords: Parkinson’s disease, Drosophila model, duch-knockdown Drosophila model,
antioxidants, purslane.
hiện nay. Bệnh Parkinson có các biểu hiện
lâm sàng về rối loạn vận động như run, cứng
cơ và cử động chậm chạp, đồng thời có dấu
hiệu chết tế bào thần kinh sinh dopamine ở
vùng liềm đen, thuộc não giữa.
Mơ hình ruồi giấm có lịch sử lâu đời trong

TỒNG QUAN
Parkinson là một trong những bệnh thối hóa
thần kinh phổ biến ở người cao tuổi, với
khoảng 3% dân số trên độ tuổi 65 mắc bệnh.
Bệnh có dấu hiệu trẻ hóa và có mức độ gia
tăng nhanh nhất trong các bệnh lý thần kinh

77



Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017

Kỷ yếu khoa học

dung môi nước: mẫu bột nghiền rau sam
được trộn đều, ngâm dầm với nước cất hai
lần, tỷ lệ m:v=1:15, sau đó ly tâm, thu dịch.
Dịch trích được sấy khơ bằng máy đơng khơ
và được trữ lạnh ở -300C.
Cao chiết rau sam được thêm vào mơi trường
ni ruồi thí nghiệm theo các nồng độ khảo
sát, ở 2 dòng ruồi giấm knock-down duch
(Kd) và dòng đối chứng (Dc).
Đánh giá tác động của cao chiết lên sinh lý
Sức ăn: Pha môi trường thường bổ sung cao
chiết rau sam theo các nồng độ thí nghiệm và
Comassive-G250 2%. Bắt ấu trùng bậc 3
sớm, cho ăn trong vòng 30 phút. Thu ấu
trùng và rửa sạch bằng PBS, chuyển vào
eppendorf 1,5ml mới, đồng hóa mẫu trong
PBS. Định lượng Commasive bằng đo chỉ số
OD tại bước sóng 595nm.
Lượng tồn dư chất kháng oxi hóa: Nghiền 50
cá thể ấu trùng bậc 3 ở các nồng độ cần khảo
sát với 500 µl nước cất 2 lần. Ly tâm lạnh ở
4oC trong 20 phút, thu dịch nổi. Pha loãng tới
các nồng độ cần thiết. Giữ lạnh và tránh
sáng. Đặt phản ứng với DPPH 50µM trong

40 phút. Đo OD ở bước song 517nm. Xác
định IC50 của từng dịng theo độ pha lỗng.
Đánh giá khả năng vận động của ruồi
giấm
Các thí nghiệm vận động chỉ thực hiện trên
cá thể đực do sinh sản của ruồi cái sẽ ảnh
hưởng đến khả năng vận động.
Thử nghiệm bò trườn: Đổ đĩa agar 2%. Cho
3-4 cá thể ấu trùng bậc 3 lên đĩa agar/lần,
quay lại từ 1-2 phút, đảm bảo cho mỗi cá thể
ấu trùng di động đều đặn ít nhất 40s/đoạn
phim. Các đoạn phim được xử lý với ImageJ,
plugin wrMTrck để thu số liệu vận tốc, biểu
đồ và thống kê (One way-ANOVA) được vẽ
và xử lý với GraphPad 6.01.
Thử nghiệm leo trèo: Ruồi trưởng thành
được bắt trong cùng một ngày sau khi thoát
kén. Sử dụng khoảng 80-100 cá thể ruồi
trưởng thành/dịng ruồi. Chuẩn bị ống 12cm,
chia vạch tính điểm, tính từ đáy mỗi vạch
cách nhau 1cm. Gây mê, bắt vào mỗi ống 10
cá thể ruồi, mỗi dòng bắt đủ 8 ống. Đập theo
chiều trọng lực 5 lần, giữ yên ít nhất 60 giây,
lặp lại 8 lần. Quay phim lại toàn bộ quá trình
từ khi bắt đầu đập. Kết quả được đọc thơng
qua chỉ số leo trèo được tính bằng tỉ lệ phần
trăm cá thể vượt vạch 6cm trong 8 lần đập.
Mỗi ống climbing ghi nhận một số liệu. Độ

nghiên cứu sinh học và vẫn còn nguyên giá

trị cho đến hiện tại. Mang nhiều đặc điểm
thuận lợi cho nghiên cứu như vịng đời ngắn,
số lượng nhiều, chi phí thấp, cũng như có
mức độ tương đồng nhất định so với người
(75% gene bệnh ở người có gene tương đồng
trên ruồi), mơ hình ruồi giấm là mơ hình tiềm
năng cho sàng lọc thuốc invivo sơ cấp.
Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1
(UCH-L1) là một protein hoạt động trong hệ
thống phân hủy protein Ubiquitin
proteasome, biểu hiện nhiều ở não và được
biết có liên quan đến bệnh Parkinson. Ở ruồi
giấm, gene tương đồng với uch-l1 là duch,
với mức độ tương đồng về trình tự khoảng
46%. Các nghiên cứu trước đây của chúng tơi
cho thấy, dịng ruồi chuyển gene làm
knockdown duch tại tế bào thần kinh sinh
dopamine biểu hiện các triệu chứng của bệnh
Parkinson bao gồm suy giảm vận động và
chết tế bào thần kinh sản sinh dopamine.
Ngoài ra, khi bổ sung thêm hợp chất kháng
oxi hóa như curcumin, vitamin C vào môi
trường nuôi ruồi, các triệu chứng do
knockdown duch được cải thiện Từ đó,
chúng tơi nhận thấy UCH-L1 có thể có liên
quan tới stress oxi hóa tế bào, đồng thời, mơ
hình ruồi knockdown duch là mơ hình tiềm
năng trong sàng lọc chất kháng oxi hóa để
điều trị bệnh Parkinson.
Nhiều công bố khoa học trước đây cho thấy

rau sam (Portulaca oleracea L.) là thực vật
có nhiều thành phần kháng oxi hóa như
vitamin A, vitamin C, acid béo omega-3,
flavonoid hay alkaloid. Bên cạnh đó, rau sam
cũng chứa dopamine và levodopa (tiền chất
của dopamine), là chất dẫn truyền thần kinh
có liên quan mật thiết đến bệnh Parkinson.
Nhằm mục đích khảo sát khả năng sử dụng
rau sam như một ứng viên thuốc điều trị
Parkinson, trong nghiên cứu này, chúng tôi
tiến hành các thí nghiệm khảo sát tác động
của cao chiết rau sam lên mơ hình ruồi
knockdown duch mang kiểu hình bệnh
Parkison.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp chiết cao rau sam
Rau sam (Portulaca oleracea L.) được thu
hái và đông khô đến khi khô hồn tồn.
Trọng lượng mẫu sau khi đơng khơ được xác
định, xay nhuyễn. Chiết cao rau sam bằng

78


Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017

suy giảm khả năng vận động được tính bằng
gốc của đường tuyến tính đi qua các giá trị
trung bình theo ngày của từng dịng. Biểu đồ
được vẽ bằng GraphPad 6.01.

Định lượng tế bào thần kinh sinh
dopamine
Tách mô não cần nhuộm (não của ấu trùng
bậc 3, não ruồi trưởng thành) trong PBS lạnh.
Cố định mô với para-formaldehit 4%.
Nhuộm miễn dịch với kháng thể bậc 1 kháng
tyroxyl hydroxylase, kháng thể bậc 2 gắn
chất phát huỳnh quang. Kết quả được ghi
nhận dưới kính hiển vi huỳnh quang Nikon

Kỷ yếu khoa học

ECLIPSE NI-U ở độ phóng đại 100X. Lượng
tế bào được đếm thủ công với phần mềm
ImageJ, thu kết quả bằng Microsoft Excel, xử
lý thống kê (One-way ANOVA) và vẽ biểu
đồ bằng phần mềm GraphPad 6.01.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Ảnh hương của cao chiết rau sam tới các
quá trình sinh lý của ruồi giấm
Sức ăn: Cao chiết rau sam có xu hướng làm
tăng khả năng ăn của ấu trùng trên cả hai
dòng Kd và Dc, nồng độ càng cao, lượng
thức ăn tiêu thụ càng lớn.

Hình 1. A: Biểu đồ tác động của cao chiết rau sam lên sức ăn của ấu trùng bậc ba dòng đối
chứng và dòng knockdown duch. B: Lượng chất kháng oxi hóa hấp thu tính theo lượng thức
ăn so với dịng Dc+1.25mM. (thí nghiệm lặp lại 6 lần, 10 cá thể cho mỗi lần khảo sát, Oneway ANOVA test, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001)
Lượng tích trữ chất kháng oxi hóa:


Hình 2. Đồ thị biểu diễn tương quan lượng chất kháng oxi hóa ở các dịng ăn cao so với dịng
ăn mơi trường nồng độ 0mg/ml
Dựa vào Hình 2 có thể nhận thấy, khả năng từ 1.25mg/ml đến 5mg/ml, tổng lượng chất
hấp thụ tốt nhất ở khoảng 0.63mg/ml. Ở các kháng oxy hóa mà ấu trùng ăn vào tăng
nồng độ cao hơn, lượng chất kháng oxi hóa khoảng 5-6 lần, đồng thời cũng tăng nhanhh
tích trữ khơng tăng nhanh theo nồng độ mà lượng chất kháng oxy hóa tích trữ (Hình 1B
gần như đạt đến mức bão hịa. Kết hợp với và Hình 2). Từ nồng độ 5mM đến 15mM,
kết quả từ thí nghiệm feeding chúng tơi nhận lượng chất kháng oxy hóa thu nạp tăng
thấy: ở dòng Kd duch, trong khoảng nồng độ khoảng 4-5 lần nhưng lượng tích trữ gần như

79


Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017

khơng đổi (Hình 1B và Hình 2). Như vậy ở
khoảng nồng độ từ 5 đến 15mg/ml, ấu trùng
đã đạt đến giới hạn hấp thụ, có khả năng gia
tăng bài tiết chất kháng oxi hóa ra ngồi.
Tác động của cao chiết rau sam lên khả
năng vận động của ruồi knockdown duch
Ở ấu trùng bậc 3: ấu trùng dòng knockdown
(Kd) có hiện tượng suy giảm khả năng vận
động so với dòng đối chứng (Dc), biểu hiện
qua việc suy giảm tốc độ di chuyển
(p<0.0001). Kết quả này cho thấy việc
knockdown gene duch trên các tế bào thần
kinh sinh dopamine làm suy giảm vận động.
Ở dịng Kd, ấu trùng ăn mơi trường cao các
nồng độ 2.5, 5 và 10 mg/ml đều cho kết quả

cải thiện khả năng vận động so với dịng Kd
khơng ăn cao (Hình 4). Ở dịng ấu trùng
Kd+15mg/ml, chúng tôi nhận thấy sự suy
giảm vận động so với dịng Kd+10mM (p<
0.01), điều này có thể do sự ảnh hưởng của

Kỷ yếu khoa học

cao chiết rau sam lên các quá trình sinh lý,
sức ăn và bài tiết của ruồi giấm ở nồng độ
15mg/ml cao hơn các nồng độ khác, làm ảnh
hưởng khả năng vận động của ấu trùng.
Ở ruồi trưởng thành: Ở lô không cho ăn môi
trường cao, chúng tơi nhận thấy khơng có sự
khác biệt rõ rệt giữa các dịng thí nghiệm.
Kết quả nhận được tương tự đối với dòng Dc
ăn cao. Tuy nhiên, kết quả climbing trên
dòng Kd ăn cao cho thấy tốc độ suy giảm vận
động có xu hướng giảm từ nồng độ 1.25
mg/ml, thấp nhất ở 2.5 mg/ml và gia tăng trở
lại ở nồng độ 10 mg/ml.m. Từ các kết quả
trên chúng tôi đi đến nhận xét, cao chiết rau
sam được bổ sung ở giai đoạn ruồi trưởng
thành có khả năng làm giảm tiến triển bệnh ở
một số nồng độ, tác động này là chuyên biệt
lên dòng knockdown duch. Nồng độ cho tác
dụng tốt nhất là 2.5mg/ml.

Hình 3. Tốc độ bị trườn của ấu trùng bậc 3 (n=30, one-way ANOVA với * p<0.05,
** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001)


Hình 4. Tốc độ suy giảm vận động của dòng Kd và dòng Dc từ 0 đến 11 ngày tuổi
Tác động của cao chiết rau sam lên tế bào (p<0.001) và trên tổng số lượng tế bào ở cả
ba cụm DM, DL1 và DL2 (p<0.05) (Hình 5).
thần kinh sinh dopamine ở ruồi giấm
Ở ấu trùng ruồi giấm bậc 3: kết quả nhuộm Xét trên dòng đối chứng, cao chiết rau sam
miễn dịch cho thấy có sự thối hóa tế bào không gây ảnh hưởng đến số lượng tế bào
thần kinh sinh dopamine ở dòng Kd so với thần kinh sinh dopamine ở cả hai nồng độ 2.5
dòng Dc trên cụm DM (p<0.05), cụm DL2 và 5 mg/ml. Xét trên dòng knockdown duch,

80


Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017

cả hai nồng độ 2.5 và 5mg/ml đều cho kết
quả cải thiện tổng số tế bào thần kinh sinh
dopamine ở 3 cụm.
Ở ruồi trưởng thành: Ở nồng độ 0, kết quả
nhuộm miễn dịch cho thấy có sự thối hóa tế
bào thần kinh sinh dopamine giữa dịng Kd
và Dc trên cụm PPM3 (p<0.001) và trên tổng
5 cụm (p<0.001) (Hình 6). Xét trên dịng đối
chứng, cao chiết rau sam không gây ảnh
hưởng đến số lượng tế bào thần kinh sinh
dopamine ở cả hai nồng độ 2.5 và 5 mg/ml
(p>0.05). Xét trên dịng knockdown duch,
khơng có sự khác biệt rõ ràng giữa lượng tế

Kỷ yếu khoa học


bào thần kinh sinh dopamine của hai dòng
Kd ăn cao và Kd nồng độ 0 trên từng cụm tế
bào thần kinh riêng lẻ (p>0.05). Tuy nhiên,
khi so sánh trên tổng số tế bào ở cả 5 cụm
khảo sát, có sự khác biệt đáng kể giữa dòng
Kd ăn cao và Kd nồng độ 0 (p<0.01) (Hình
6F), cao chiết rau sam ở nồng độ 2.5 và
5mg/ml cải thiện suy thoái tế bào thần kinh
sinh dopamine trên dòng knockdown duch.
Do sự cải thiện phân tán rải rác ở nhiều cụm
với số lượng nhỏ, nên không nhận thấy khác
biệt khi xét từng cụm.

Hình 5. 1-Biểu đồ số lượng tế bào thần kinh sinh dopamine ở thùy não ấu trùng bậc ba. A:
cụm DM, B: cụm DL1, C: cụm DL2, D: tổng số tế bào 3 cụm (DM, DL1, và DL2) (n=8,
Kruskal Wallis test, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001). 2-Hình chụp não ấu
trùng bậc 3

Hình 6. Biểu đồ số lượng tế bào thần kinh sinh dopamine ở não ruồi trưởng thành. (n=8, A,
C, D, E, F: One-way ANOVA, B: Kruskal-Wallis test, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001,
**** p<0.0001)

81


Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017

Kỷ yếu khoa học


của đề tài đóng góp dữ liệu khoa học cho
việc sử dụng cao chiết rau sam trong hỗ trợ
điều trị bệnh Parkinson, đặc biệt cho các
trường hợp đột biến hoặc giảm biểu hiện
gene uch-l1. Đồng thời phát triển ứng dụng
mơ hình ruồi giấm knockdown duch sàng lọc
thêm hợp chất kháng oxi hóa có tác động tích
cực lên cơ thể sống và cải thiện tình trạng
bệnh Parkinson.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Cao chiết rau sam làm giảm suy thoái vận
động do knockdown duch ở ấu trùng và làm
chậm quá trình tiến triển bệnh ở ruồi trưởng
thành, cũng như làm giảm sự thối hóa tế bào
thần kinh sản sinh dopamine. Nồng độ rau
sam thích hợp cho tác động cải thiện kiểu
hình bệnh PD và hạn chế tác động lên sinh lý
trên mơ hình ruồi giấm là 2.5 mg/ml. Kết quả

TÀI LIỆU THAM KHẢO
FEIGIN, V.L., et al., Global, regional, and national burden of neurological disorders during
1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet
Neurology, 2017. 16(11): p. 877-897.
MARTINS, W.B., et al., Neuroprotective effect of Portulaca oleracea extracts against 6hydroxydopamine-induced lesion of dopaminergic neurons. Anais da Academia
Brasileira de Ciências, 2016. 88(3): p. 1439-145.

82