Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

Kỷ yếu khoa học

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ
NĂNG PHÂN HỦY OCTYLPHENOL POLYETHOXYLATE (OPEOn)
TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Ngơ Thị Kim Ngân*, Nguyễn Yến Nhi, Trương Xuân Trung
Trường Đại học Tôn Đức Thắng
*Tác giả liên lạc:
TĨM TẮT
Octylphenol polyethoxylate (OPEOn) có tên công nghiệp là Triton X-100, là hợp
chất hoạt động bề mặt do con người tổng hợp, nó có khả năng tẩy rửa, phân tán
và nhũ hóa rất tốt vì thế được sử dụng rộng rãi trong nhiều sản phẩm công nghiệp
như sơn, bột giấy, vải, thuốc trừ sâu... Chúng có thể “ngụy trang” thành các nội
tiết tố (hormone) tự nhiên và do đó nó có khả năng hoạt động như các chất phá
hủy hệ thống nội tiết của sinh vật thủy sinh. Ngày nay, các tác động không mong
muốn của hóa chất lên sức khỏe con người đã được quan tâm và hướng xử lí
thường ưu tiên các biện pháp xử lý sinh học. Trong nguyên cứu này, chúng tôi đã
phân lập được 18 chủng vi khuẩn gram âm có khả năng phân hủy OPEOn từ ba
nguồn mẫu bao gồm đất nơng nghiệp, nước sơng và bùn sơng. Trong đó, 3 chủng
vi khuẩn có khả năng sinh trưởng và phát triển cao nhất được chọn lọc, giải trình
tự để định danh là Klebsiella variicola S9, Klebsiella sp. B12 và Klebsiella
variicola W2. Các trình tự đã được đưa lên ngân hàng dữ liệu genebank với các
số accession numbers lần lượt là MH578615; MH578616 và MH578617.
Từ khóa: Chất hoạt động bề mặt, Octylphenol Polyethoxylate, Triton X-100.
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF OCTYLPHENOL
POLYETHOXYLATE (OPEOn) - BIODEGRADING BACTERIA
TRAINS IN HO CHI MINH CITY
Ngo Thi Kim Ngan*, Nguyen Yen Nhi, Truong Xuan Trung
Ton Duc Thang University

*Corresponding Author:
ABSTRACT
Octylphenol polyethoxylate (OPEOn) is a synthetic surfactant compound, which
has the ability to cleanse, disperse, and emulsify very well so it is widely used in
many industrial products such as paints, pulp and cloth, pesticides... They can
“camouflage” into the natural hormones and therefore are capable of acting as
endocrine disrupters of aquatic animals. Todays, the unwanted effects of
chemicals on human health have been the subject of concern and the direction of
treatment often prioritizes biological treatments. In this study, we isolated 18
gram-negative bacterial strains capable of decomposing OPEOn from three
sources including agricultural land, river water and river mud. Three of the
highest growth and developmental strains were selected for sequencing namely
Klebsiella variicola S9, Klebsiella sp. B12 and Klebsiella variicola W2. The
sequences were posted to Genebank data with accession numbers as MH578615,
MH578616 and MH578617.
Keywords: Biodegradable, Octylphenol Polyethoxylate, Triton X-100.
121


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

MỞ ĐẦU
Alkylphenol ethoxylate là các chất hoạt
động bề mặt khơng chứa ion, bao gồm
một nhóm alkylphenol phân nhánh kết
hợp với chuỗi ethoxylate (Hình 1). Các
alkylphenol chính được sử dụng là
nonylphenol (NP) và octylphenol (OP)
với nonylphenol ethoxylates (NPEOn)
chiếm khoảng 80% thị trường thế giới và

octylphenol ethoxylates (OPEOn) chiếm
20% còn lại (White et al., 1994). Sản
lượng chất hoạt động bề mặt trên toàn thế
giới trong năm 2008 là 13 triệu tấn. Trong
năm 2014, thị trường thế giới về chất hoạt
động bề mặt đạt khối lượng hơn 33 tỷ đô
la Mỹ. Các nhà nghiên cứu thị trường
mong đợi doanh thu hàng năm tăng 2,5%
mỗi năm lên khoảng 40,4 tỷ đô la Mỹ cho
đến năm 2022 (Alexander Stark, 2017).
Chiều dài của chuỗi ethoxylate thay đổi từ
1 đến 50 đơn vị ethoxy, tùy thuộc vào ứng
dụng. (A. Michael Warhurst, 1995). Ký
hiệu “X” của “Triton X-100” bắt nguồn
từ octylphenol trùng ngưng với ethylene
oxide. Số (“-100”) liên quan đến số đơn
vị ethylene oxide trong cấu trúc. X100
chứa 9,5 đơn vị ethylene oxide trong mỗi
phân tử, với trọng lượng phân tử trung
bình 625. Cấu trúc OPEO với X gần bằng
9.5 (Chen et al. 2005).
OPEOn tồn tại trong các nguồn nước nhà
máy, nước thải sinh hoạt của các khu dân
cư, đất nông nghiệp sẽ gây hậu quả nặng

Kỷ yếu khoa học

nề không chỉ cho sinh vật dưới nước mà
còn cho cả con người. Phát triển và
nghiên cứu một phương pháp hiệu quả,

đơn giản, không tốn nhiều chi phí, khơng
gây ảnh hưởng về mặt sức khỏe con
người để xử lí OPEOn là điều hồn tồn
hợp lý và cần thiết ở Việt Nam hiện nay.
Nhiều nghiên cứu cho quá trình loại bỏ
OPEOn trong mơi trường đã và đang
được tiến hành. OPEOn có thể bị phân
hủy trong mơi trường thủy sinh bằng
phương pháp hóa học sử dụng bức xạ siêu
âm để tấn cơng chuỗi ethoxylated (EO) và
vịng thơm (Chen et al., 2005). Tuy nhiên,
những kỹ thuật này đòi hỏi thiết bị đắt tiền
với các quy trình vận hành phức tạp và
điều này hạn chế việc áp dụng chúng
trong thực tiễn.
Chúng ta ngày càng quan tâm đến các tác
động không mong muốn của chất hóa học
lên sức khỏe con người nên hướng xử lí
mơi trường với các biện pháp sinh học
khơng gây hại cho sinh vật vẫn là nên
được quan tâm hơn so với các biện pháp
xử lí hóa học tốn kém. Phương pháp phân
hủy sinh học OPEOn bằng cách sử dụng
các dòng vi khuẩn được tiến hành trên thế
giới và được coi là giải pháp hữu hiệu ít
tốn kém cho quá trình xử lý. Tuy nhiên,
tại Việt Nam những nghiên cứu về phân
hủy OPEOn vẫn còn thiếu nên ta càng
phải nghiên cứu và phát triển phương
pháp này tại Việt Nam.


Hình 1. Cấu trúc phân tử của OPEOn
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Chất hoạt động bề mặt và môi
trường nuôi cấy vi khuẩn

Chất hoạt động bề mặt OPEOn (tên
thương mại, Triton X-100) được mua
từ VWR Chemical Co. (Pháp) với độ
tinh khiết 98% và đây là vật liệu để

122


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

đánh giá sự phân hủy sinh học của vi
khuẩn. Cấu trúc phân tử của Triton X100 được thể hiện trong hình 1. Tất cả
các chủng được thử nghiệm trong
nghiên cứu này được ni cấy trong
mơi trường M9 có chứa Triton X-100
là nguồn cacbon duy nhất. Thành phần
của 1L M9 stock 10X bao gồm 75.2 g
Na2HPO4.2H2O, 30g K2HPO4, 5g
NH4Cl, 5 g NaCl. Tất cả các hóa chất
được mua từ Cơng ty Hóa chất Merck
(Darmstadt, Đức) với độ tinh khiết 98–
99,5%. Mơi trường tăng trưởng và các
chất pha lỗng cho các dung dịch được

tiệt trùng bằng cách hấp tiệt trùng
(121oC, trong 15 phút) cho các thí
nghiệm ni cấy.
Nguồn của vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn được nghiên cứu
trong nghiên cứu này được phân lập từ các
mẫu đất nông nghiệp, nước sông và bùn
sơng, nơi có mức độ ơ nhiễm cao tại
Thành phố Hồ Chí Minh. Để sàng lọc các
chủng vi khuẩn phân hủy Triton X-100 từ
các mẫu môi trường bị ô nhiễm, 0.1%
Triton X-100 đã được thêm vào trong môi
trường M9 như là nguồn cacbon duy nhất.
Sự tăng sinh tiến hành bằng cách chuyển
một phần mười của môi trường nuôi cấy
sang một mơi trường mới, lặp lại ít nhất 3
lần. Sau khi nuôi cấy phù hợp với nồng độ
Triton X-100, và tốc độ tăng trưởng của vi
khuẩn tăng lên, nồng độ Triton X-100 đã
tăng lên 0.5%. Sự phát triển của vi khuẩn
và nồng độ của Triton X-100 cho tất cả
các chủng được đánh giá.
Phân lập và xác định các đặc điểm
hình thái của vi khuẩn
Chọn lọc các chủng vi khuẩn phát triển
mạnh và có hình thái khuẩn lạc khác
nhau để tiếp tục nghiên cứu. Quan sát
các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc
và nhuộm gram để quan sát các đặc
điểm của chủng vi khuẩn. Soi dưới

kính hiển vi nhúng dầu với độ phóng
đại 100X.
Phương pháp phân tích

Kỷ yếu khoa học

Máy quang phổ (6705 UV/VIS,
Jenway, Anh) được sử dụng để đo sự
phát triển của vi khuẩn bằng cách sử
dụng độ hấp thụ ở OD 600 nm để ước
tính mức độ của sự phát triển.
Các chủng được giải trình tự và định
danh
Trình tự Nucleotide của các đoạn
rDNA khuếch đại được tìm kiếm trong
GenBank ở NCBI (National Center for
Biotechnology
Information,
/>blast.cgi) và căn chỉnh bằng cách sử
dụng Bioedit và ClustalX. Đưa trình tự
lên ngân hàng genebank. Tạo cây phân
lồi với các chủng có khả năng phân
hủy Triton X-100 bằng Njplot.
Xác định khả năng phân hủy
Octylphenol Polyethoxylate
Đo full scan mẫu môi trường
M9+0.5% Triton X-100 trước khi nuôi
cấy và mẫu nuôi cấy. Tất cả các mẫu
trước khi đo full scan được ly tâm ở
13.000 vòng/phút trong 10 phút.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả phân lập vi khuẩn
Sau 36 giờ, ở mẫu nước sơng, khuẩn
lạc đa số có dạng vết, bằng phẳng, màu
trắng đục, đường kính khoảng 3-4mm,
một số có hình trịn, nhỏ, hơi lồi, màu
trắng đục, khơng đều, mật độ thưa.
Trong khi ở mẫu đất nông nghiệp,
khuẩn lạc có dạng hình trịn, màu trắng
đục, khơng đều, hơi lồi, mật độ thưa.
Và mẫu bùn sơng, khuẩn lạc có dạng
hình trịn, nhỏ, màu trắng đục, khơng
đều, hơi lồi, mật độ dày.
Sự phát triển của các chủng vi khuẩn
đã được ghi lại qua 24 giờ, 36 giờ và
48 giờ. Nhìn vào biểu đồ, có thể thấy
được các chủng vi khuẩn khác nhau thì
có sự phát triển khác nhau. Từ đó, sàng
lọc được các vi khuẩn có sự phát triển
cao nhất: 1.2, 1.9,1.13 ở mẫu đất, 2.2,
2.4, 2.12 ở mẫu bùn sông và 3.2, 3.6,
3.11 ở mẫu nước sông.

123


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

Kỷ yếu khoa học


Đường cong tăng trưởng vi khuẩn

∆OD (600nm)

Đường cong tăng trưởng của một số chủng vi
khuẩn phân lập
1.5

1.2

1

1.9

0.5

1.13

0
1

7

14

27

Time (days)

35


39

2.2
2.4

Hình 2. Đồ thị thể hiện đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn được
lọc từ mẫu đất nông nghiệp (1.2, 1.9, 1.13), mẫu bùn sông (2.2, 2.4, 2.12) và
mẫu nước sơng (3.2, 3.6, 3.11)
Nhìn vào biểu đồ, có thể thấy được sự MH578615; 2.12: MH578616; 3.2:
tăng trưởng khá mạnh mẽ ở một số MH578617 tương ứng với Klebsiella
chủng vi khuẩn. Trong đó, ở mẫu đất variicola S9, Klebsiella sp. B12,
nơng nghiệp, mẫu 1.2 có sự phát triển Klebsiella variicola W2.
cao nhất, đạt được trên 1.2 ở 600nm, Kết quả khả năng phân hủy
tiếp đó là mẫu 1.13 và 1.2 lần lượt chỉ Octylphenol Polyethoxylate
đạt khoảng 0.5 và 0.35. Ở mẫu bùn Có thể thấy rằng, sau khi ni cấy 14
sơng, chủng vi khuẩn có sự phát triển ngày, hàm lượng Triton có sự sụt giảm
cao nhất là 2.12 với OD bằng 1.2, 2 rõ rệt. Môi trường ban đầu có OD là
mẫu cịn lại là 2.2 và 2.4 đạt lần lượt là 0.78, tuy nhiên sau khi cho vi khuẩn
0.87 và 0.32. Ở mẫu đất, các chủng vi vào ni cấy 14 ngày thì OD là 0.28.
khuẩn cũng có sự phát triển khác nhau Kết luận: Chủng vi khuẩn đang nuôi
với mẫu 3.2, 3.6 và 3.11 lần lượt là cấy có khả năng phân hủy Triton X1.05, 0.92 và 0.82. Dựa vào đó, có thể 100.
chọn lọc được những chủng vi khuẩn
có sự phát triển cao và đường biểu diễn KẾT LUẬN
có xu hướng đi lên như mẫu 1.9, 2.12, Các chủng vi khuẩn phân lập được đều
3.2 để giải trình tự và định danh.
là vi khuẩn Gram âm, được sàng lọc từ
các mẫu đất nông nghiệp, nước sông và
Kết quả đặc điểm vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn được chọn lọc bùn sơng, những nơi có mức độ ơ

được nhuộm gram và quan sát hình nhiễm cao. Trong nghiên cứu này, từ
thái. Kết quả sau khi quan sát bằng 18 chủng vi khuẩn phân lập được, 3
kính hiển vi ở độ phóng đại 100X. Các chủng vi khuẩn phát triển mạnh nhất đã
chủng vi khuẩn được chọn lọc có hình được giải trình tự, định danh là
thái khác nhau và đều thuộc Gram âm. Klebsiella variicola S9, Klebsiella sp.
B12, Klebsiella variicola W2. Trình tự
Kết quả định danh
Trình tự gen 16S rRNA xác định trong của 3 chủng này đã được đưa lên ngân
nghiên cứu này đã được gửi vào cơ sở hàng Genebank với số accession
dữ liệu ngân hàng gen của NCBI dưới numbers lần lượt là MH578615,
những accession number: 1.9: MH578616 và MH578617.
124


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

Các chủng vi khuẩn phân lập được có
khả năng phân hủy Triton X-100 và
phát triển mạnh trong điều kiện phát
triển bình thường (nhiệt độ phịng,
khơng lắc), hóa chất sử dụng cho mơi
trường ni cấy dễ tìm và chi phí thấp.
Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho

Kỷ yếu khoa học

việc ứng dụng nghiên cứu này vào thực
tiễn để xử lý các vấn đề môi trường
trong tương lai. Việc sử dụng vi khuẩn
trong quá trình phân hủy sinh học

Triton X-100 khơng chỉ hiệu quả về
mặt chi phí mà cịn đảm bảo an toàn về
mặt sinh thái.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
ALEXANDER STARK (2017). Report on the Global Market for Surfactants.
Market Study: Surfactants, Ceresana Publishes Market Analysis, 3rd
edition.
CHIU TS, HSIEH CY, MIAW CL, LIN CN, CHANG TC, YEN CH, CHIOU
MT (2014). Alkylphenol polyethoxylate derivatives in groundwater and
blood samples collected from pig herds in Taiwan. Veterinary Medical
Science,76 (7), 971–975.
H.J. YANG. Isolation, Identification of a octylphenol polyethoxylate degradaing
strains and its degradation study. Zhongguo Huanjing Kexue/China
Environmental Science. 34 (6):1556-1563, June 2014.
HSI-JIEN CHEN, DYI-HWA TSENG, SHIR-LY HUANG (2005).
Biodegradation of octylphenol polyethoxylate surfactant Triton X-100 by
selected microorganisms. Bioresource Technology, 96 (13), 1483-1491.
MICHAEL WARHURST (1995). An Environmental Assessment of Alkylphenol
Ethoxylates and Alkylphenols. Friend of the Earth, 7/2018, Việt Nam.

125