Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

Kỷ yếu khoa học

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THÚC ĐẨY TĂNG TRƯỞNG THỰC VẬT IN
VIVO CỦA CÁC VI KHUẨN LIÊN KẾT THỰC VẬT TRÊN MỘT SỐ
LOẠI CÂY NGŨ CỐC TRỒNG TRONG BÌNH LEONARD
Châu Thị Huyền*, Đậu Thị Minh, Nguyễn Hồng Trí,
Đặng Thị Ngọc Thanh, Hồng Minh Tâm
Trường Đại học Sài Gịn
*Tác giả liên lạc:
TĨM TẮT
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm tìm ra các dịng vi khuẩn liên kết thực vật
có tác động tốt trên sự tăng trưởng của cây lúa và cây ngô một tháng tuổi. Hạt
được khử trùng và gieo tạo cây con vô trùng và được chủng vi khuẩn trước khi
chuyển vào trồng trong bình Leonard với dung dịch dinh dưỡng bao gồm
Hoagland bán phần và Hoagland bán phần không N; đối chứng là nước cất vơ
trùng. Trong 7 dịng vi khuẩn liên kết thực vật đã khảo sát, có 3 dịng BD2, BD3
và MT1 cho tác động tốt nhất trên cả hai loại cây khi làm tăng diện tích lá 39 –
166%, tăng khối lượng rễ khô 62 – 171% và tăng khối lượng thân lá khơ 50 –
172%. Ba dịng này đã được định danh bằng phương pháp MALDI và tiếp tục
được khảo sát khả năng sản xuất siderophore, khả năng đối kháng sinh học. Kết
quả định danh cho thấy dòng BD2 tương đồng với Bacillus pumilus, hai dòng
MT1 và BD3 tương đồng với Bacillus subtilis. Cả 3 dịng đều có khả năng sinh
siderophore và có khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị Gram âm và Gram dương.
Trong đó, dịng BD2 sản xuất siderophore tốt nhất và dòng MT1 kháng khuẩn tốt
nhất. Cả 3 dịng BD2, BD3 và MT1 có thể được sử dụng phối hợp trong cùng chế
phẩm phân bón vi sinh vì chúng khơng đối kháng lẫn nhau.
Từ khóa: Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, bình Leonard, đối kháng sinh học,
siderophore, thúc đẩy tăng trưởng thực vật, vi khuẩn liên kết thực vật.
ASSESSMENT OF POTENTIALS FOR IN VIVO PLANT GROWTH

PROMOTING OF PLANT ASSOCIATED BACTERIA IN TYPES OF
CROP PLANTS CULTIVATED IN LEONARD’S JARS
Chau Thi Huyen*, Dau Thi Minh, Nguyen Hoang Tri,
Dang Thi Ngoc Thanh, Hoang Minh Tam
Sai Gon University
*Corresponding Author:
ABSTRACT
The research has been conducted to identify the strains of plant associated
bacteria possessing positive impact on growth of one-year old rice and maize.
The seedlings growing from sterilized seeds inoculated with the bacteria cultures,
then cultivated in Leonard’s jars with half-strength Hoagland's solutions, halfstrength Hoagland's solutions without N, and sterile distilled water as a control.
Of the 7 bacteria strains evaluated, three of them, BD2, BD3 and MT1 showed
the best effects on both types of plants, increasing the leaf area, the dry root mass
and dry leafed stem mass about from 39 to 166%, 62 - 171%, and 50 - 172%,
respectively. These three strains have been identified by the MALDI method and
91


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

Kỷ yếu khoa học

continue to be investigated for their abilities of producing siderophores, and
biological antagonism. The identification results indicate that the BD2 isolate is
similar to Bacillus pumilus, the two isolates MT1 and BD3 are homologous to
Bacillus subtilis. All three strains are capable of producing siderophore and are
capable of inhibiting Gram-negative and Gram-positive indicator bacteria
strains. Specially, the BD2 isolate has the best capability of producing
siderophore and the MT1 isolate has the best capability of inhibiting the growth
of indicator bacteria. All three strains of BD2, BD3 and MT1 can be used

coordinately in an inoculant as they are not resistant to one other.
Keywords: Antagonism, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Leonard’s jar, plant
Associated Bacteri, plant Growth Promoting Bacteria, siderophore.
lúa. Đây là bước nghiên cứu có ý nghĩa
nhất định trong chế tạo phân bón vi
sinh có phổ vật chủ rộng cho các cây
lương thực. Bên cạnh đó, việc xác định
đặc tính đối kháng sinh học một cách
gián tiếp thông qua khả năng sinh
siderophore hay tính kháng khuẩn của
các dịng được tuyển chọn cịn giúp ích
cho việc khai thác các khía cạnh có lợi
khác của chế phẩm, ngồi chức năng
“phân bón”. Cơng tác định danh đã
thực hiện cũng cho phép sự cân nhắc
về tính an toàn sinh học của chế phẩm
khi triển khai ứng dụng thực nghiệm
ngoài đồng sau này.
Trong 10 năm gần đây, đã có nhiều
cơng bố về tác động thúc đẩy tăng
trưởng thực vật của các vi khuẩn liên
kết thực vật trên cây ngơ và cây lúa.
Các thí nghiệm nghiên cứu thường tiến
hành trên quy mô trồng cây trong ống
nghiệm và trong chậu; ít có thử nghiệm
ngồi đồng được báo cáo. Tại Thái
Lan, Piromyou et al. (2011) đã tiến
hành nghiên cứu tác động của
Pseudomonas
sp.

SUT19
và
Brevibacillus sp. SUT 47 lên sự nảy
mầm và tăng trưởng của cây ngơ trồng
trong bình Leonard. Việc chủng vi
khuẩn đã giúp tăng sinh khối cây ngô,
đặc biệt trong giai đoạn 5 đến 8 tuần
tuổi. Tại Brazil, Rodrigues et al. (2016)
đã phân lập được 136 dịng vi khuẩn
liên kết cây mía. Trong đó có 83 dịng
biểu thị khả năng hịa tan phosphate, cố

MỞ ĐẦU
Lúa gạo (Oryza sativa L.) và ngô (Zea
mays L.) là hai trong số các loại ngũ
cốc được sử dụng làm lương thực
chính của một số dân tộc trên thế giới.
Canh tác cây lương thực cũng như các
loại cây trồng khác cần dựa trên
nguyên tắc của nông nghiệp “sinh thái”
bền vững và giảm thiểu các tác động
tiêu cực đối với môi trường và sức
khỏe con người. Nhắm đến mục tiêu
này, các nhà nghiên cứu thường tập
trung khai thác lợi ích của các vi khuẩn
thúc đẩy tăng trưởng thực vật (trong đó
có các vi khuẩn liên kết thực vật) như
là các chế phẩm bổ sung cho cây. Các
vi khuẩn giúp thúc đẩy tăng trưởng
thực vật thơng qua các đặc tính tốt như

cố định đạm, hịa tan phosphate khó
tan, tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng
như IAA, và làm tăng khả năng đề
kháng bệnh (Siciliano et al., 2001).
Trong các nghiên cứu trước đây, một
bộ sưu tập gồm các dòng vi khuẩn liên
kết cây mía và cây ngơ có các khả năng
cố định đạm, hòa tan lân, và tổng hợp
IAA đã được tạo ra và hiện đang lưu
trữ ở phịng Thí nghiệm Vi sinh vật
học, trường Đại học Sài Gòn. Trong
nghiên cứu này, 7 dịng vi khuẩn có
đặc tính tốt được lựa chọn từ bộ sưu tập
lại tiếp tục được đánh giá khả năng
thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vivo
trên chính cây chủ như cây ngô, hay
mở rộng sang một cây chủ khác là cây
92


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

định đạm, sản xuất IAA, HCN,
ammonia, chitinase, cellulase và
pectinase. Bảy dòng tốt nhất thuộc các
chi Klebsiella, Enterobacter và
Pantoea đã được thử nghiệm về khả
năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của
chúng trên cây ngô trồng trong chậu,
giai đoạn 0 – 40 ngày tuổi. Qua đó, có

5 dịng đã được các tác giả đề xuất như
các dòng tiềm năng cho sản xuất phân
bón sinh học.

Kỷ yếu khoa học

với ngâm hạt trong NaOCl hoặc
Ca(OCl)2 10% trong thời gian từ 5, 10,
đến 15 phút. Sau mỗi công đoạn tiến
hành rửa sạch hóa chất bằng nước cất
vơ trùng. Giai đoạn cuối, hạt được rửa
sạch bằng nước cất vô trùng 4 lần. Đem
ủ hạt trong đĩa Petri chứa môi trường
LB 0,7% agar. Sau 2 ngày, quan sát
nhằm loại bỏ các hạt có biểu hiện
nhiễm khuẩn. Các hạt khơng nhiễm sẽ
được chuyển vào bình nuôi cấy chứa
môi trường 0,7% agar, 1% sucrose, đặt
ở 26±2oC, chiếu sáng bằng đèn (cường
độ 2000 lux, 12 giờ/ngày).

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Đối tượng nghiên cứu là 7 dòng vi
khuẩn đã được đánh giá khả năng cố
định đạm, hòa tan phosphate và tổng
hợp IAA; bao gồm 4 dòng vi khuẩn
liên kết cây ngô (BD1, BD2, BD3,
BT2), và 3 dịng liên kết cây mía

(MT1, MR1, MR2).
Hai giống ngũ cốc được sử dụng trong
nghiên cứu PGP (Plant Growth
Promoting) in vivo là giống lúa gạo
OM5451 và giống ngô nếp nù TB277.
Phương pháp nghiên cứu
Hoạt hóa vi khuẩn và tạo dịch huyền
phù
Sau thời gian lưu trữ, 7 dòng vi khuẩn
đã được hoạt hóa, cấy chuyển trên mơi
trường phân lập, và kiểm tra lại độ
thuần. Tiến hành ni các dịng thuần
trong mơi trường LB lỏng (Bertani et
al., 1951), điều kiện lắc 120 vòng/phút,
trong 48 giờ. Thu dịch huyền phù, so
độ đục và điều chỉnh mật số tế bào về
chuẩn McFarland 0,5 (1,5 x 108
CFU/mL theo Sutton, 2011) bằng máy
đo quang phổ Pharmacia Biotech
Novaspec II (Hoa Kỳ), sử dụng bước
sóng 600 nm.
Khử trùng hạt, tạo cây con vô trùng và
chủng vi khuẩn vào cây con
Hạt lúa, hạt ngô được rửa sạch bằng
nước cất vô trùng (4 lần), lắc trong cồn
70o trong thời gian 5 phút và kết hợp

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả khử trùng hạt và tạo cây con
vô trùng trong ống nghiệm

Quy trình khử trùng hạt tốt nhất đối với
cả 2 loại hạt ngô và lúa là sử dụng chất
diệt khuẩn Ca(OCl)2 nồng độ 10%
trong 10 phút. Tỷ lệ hạt sống, nảy mầm
và sạch khuẩn đã đạt được là 96,7% đối
với hạt ngô và 94,4% đối với hạt lúa.
Sau khi chuyển các hạt không nhiễm
vào môi trường agar bán đặc, tỷ lệ cây
nảy chồi, mọc rễ và khơng có dấu hiệu
nhiễm trùng là 96,7% ở ngô và 97,2%
ở lúa. Như vậy, hiệu quả chung của
việc khử trùng hạt và tạo cây sạch
khuẩn trong ống nghiệm là 93,5% đối
với ngô; và 91,8% đối với lúa. Đây là
một bước quan trọng nhằm nâng cao
điều kiện kiểm sóa t (gnotobiotic
conditions) (Mehnaz, 2011) mà các thí
nghiệm trồng cây in vitro thường thực
hiện nhằm loại bỏ tác động của các vi
sinh vật ngoại lai cịn sót trên mẫu mô
thực vật.
Ảnh hưởng của yếu tố môi trường
trồng cây và yếu tố vi khuẩn liên kết
thực vật lên sự tăng trưởng của cây
lúa, cây ngô một tháng tuổi
Đối với chiều dài rễ, khối lượng tươi
và khối lượng khô của rễ cây
Đối với cây lúa một tháng tuổi, trong
môi trường trồng cây là nước cất, dòng
93



Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

BD2 có tác động tốt nhất trên chiều dài
rễ khi làm tăng chiều dài thêm 79% so
với đối chứng khơng chủng vi khuẩn.
Trong khi đó đối với cây ngơ, dịng
MT1có tác làm tăng thêm 112% so với
đối chứng không chủng vi khuẩn.
Chiều dài rễ cây gia tăng khi cây được
trồng trong điều kiện thiếu dinh dưỡng
(Đặng Thị Ngọc Thanh và cs., 2016).
Cây có thể tăng cường sự phát triển rễ
bên để tăng cường sự tiếp cận các
nguồn dinh dưỡng thơng qua sự điều
chỉnh các hormone, trong đó hormone
từ các vi khuẩn liên kết thực vật
(Hawkesford et al. 2012; Liu et al.
2008). Như vậy khối lượng rễ, đặc biệt
là khối lượng chất khô của rễ là chỉ tiêu
phản ánh sự phát triển của rễ tốt hơn so
với chiều dài rễ.
Đối với chiều cao cây, khối lượng tươi
và khối lượng chất khô của thân-lá
Kết quả nghiên cứu cho thấy trong
cùng một loại môi trường trồng cây, tất
cả các nghiệm thức có chủng vi khuẩn
đều cho diện tích lá tốt hơn so với đối
chứng không chủng vi khuẩn. Các

nghiệm thức cho tác động tốt nhất trên
diện tích lá lúa là BD1, BT2, BD3,
MR2, MT1. Đặc biệt, dịng MT1 có tác
dụng làm tăng diện tích lá thêm 69%
khi trồng cây trong mơi trường
Hoagland bán phần không đạm và tăng
thêm 70% khi trồng cây trong mơi
trường Hoagland. Dịng BD3 có tác
dụng làm tăng diện tích lá lúa thêm
51% khi trồng cây trong mơi trường

Kỷ yếu khoa học

Hoagland bán phần. Trong khi đó trên
cây ngơ một tháng tuổi, các dịng có tác
động tốt trên diện tích lá là MT1, MR1,
BD2.
Kết quả tuyển chọn và định danh các
dòng vi khuẩn liên kết thực vật
Kết quả định danh bằng phương pháp
MALDI cho thấy dòng BD2 tương
đồng với Bacillus pumilus, 2 dòng
MT1 và BD3 cùng tương đồng với
Bacillus subtilis. Đây là các vi khuẩn
Gram dương, sinh nội bào tử nên có
khả năng chống chịu và phát tán tốt.
Bacillus subtilis đã được biết đến nhiều
về khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực
vật, trợ sinh và ứng dụng trong nhiều
chế phẩm thương mại do có tính an

tồn sinh học cao. Bacillus pumilus đã
được chứng minh hiệu quả thay thế
một phần phân bón hóa học (Kuan et
al., 2016). Vi khuẩn này cũng có khả
năng sinh IAA, siderophore, kiểm sóa
t nấm Fusarium, và gia tăng chiều dài
của rễ và chồi ở cây khoai tây
(Heidarzadeh et al., 2015).
Khả năng sản xuất siderophore và
khả năng ức chế vi khuẩn
Kết quả thí nghiệm định tính cho thấy
cả 3 dịng BD2, BD3 và MT1 đều có
khả năng sinh siderophore và có khả
năng ức chế 2 chủng vi khuẩn chỉ thị
Gram âm và Gram dương. Trong đó,
dịng BD2 sản xuất siderophore tốt
nhất và dịng MT1 kháng khuẩn tốt
nhất (0,2 cm đối với E. coli và 0,5 cm
đối với S. aureus) (Hình 1).

Hình 1. Khả năng sinh siderophore (A), kháng E. coli (B), và kháng S. aureus
(C) của các dòng vi khuẩn tuyển chọn, đối chứng sử dụng nước cất (ĐC)
94


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

Kỷ yếu khoa học

BD3 đều có khả năng sinh siderophore

và kháng vi khuẩn chỉ thị. Cả 3 dòng
BD2, MT1, BD3 có thể được sử dụng
phối hợp trong cùng chế phẩm phân
bón vi sinh vì khơng đối kháng lẫn
nhau.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Trong 7 dòng vi khuẩn liên kết thực
vật, có 3 dịng có tác động tốt trên sự
tăng trưởng thực vật của cả hai loại cây
ngũ cốc là ngơ và lúa; đó là Bacillus
pumilus BD2, B. subtilis MT1 và B.
subtilis BD3. Cả 3 dòng BD2, MT1,

TÀI LIỆU THAM KHẢO
BHARUCHA U. D., PATEL K. C., TRIVEDI U. B, 2013. In vitro screening of
isolates for its plant growth promoting activities from the rhizosphere of
Alfalfa (Medicago Sativa). Journal of Microbiology and Biotechnology
Research.3 (5):79-88.
DANG THI NGOC THANH AND CAO NGOC DIEP: Isolation,
Characterization and Identification of Endophytic Bacteria in Maize (Zea
Mays L.) Cultivated on Acrisols of the Southeast of Vietnam. American
Journal of Life Sciences 2014; 2(4): 224-233 Published online August 30,
2014.
HEIDARZADEH, N., & BAGHAEE-RAVARI, S. (2015). Application of
Bacillus pumilus as a potential biocontrol agent of Fusarium wilt of
tomato. Archives of Phytopathology and Plant Protection, 48(13-16), 841849.
KUMAR ET AL., 2011. ISR: Induction of Systemic Resistance of host plant by
PGPR.
PIROMYOU, P., B. BURANABANYAT, P. TANTASAWAT, P.

TITTABUTR, N. BOONKERD AND N. TEAUMROONG, 2011. Effect
of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) inoculation on microbial
community structure in rhizosphere of forage corn cultivated in Thailand.
Eur J Soil Biol. 47(1): 44-54.

95