ĐỀ TÀI: TẠO DÒNG TỨ BỘI TỪ GIỐNG CÂY
ĂN QUẢ CÓ MÚI ĐỊA PHƯƠNG BẰNG
XỬ LÝ COLCHICINE


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
1. Vật liệu và phương pháp ............................................................................ 2
1.1. Vật liệu: ................................................................................................ 2
1.2. Phương pháp: ....................................................................................... 2
2. Các phương pháp khác tham khảo như: ..................................................... 3
3. Kết quả và thảo luận: ................................................................................. 4
4. Xác định các cành tứ bôi thể sau khi xử lý colchicin ................................ 6
5. Phần kết luận: ............................................................................................. 7
TÀI LIỆU THAM KHẢO: ............................................................................. 9


ĐẶT VẤN ĐỀ
Quả không hạt đã xuất hiện trên thị trường từ vài năm nay. Điển hình là
một số loại quả như ổi, mận chanh cam dưa hấu… đây là những sản phẩm
100% trồng tại Việt Nam. Nhưng nguồn chanh từ Mỹ hoặc ổi, mận từ Thái
Lan… qua các quá trình nghiên cứu đã cho ra đời các loại quả thích hợp với
thổ nhưỡng tại Việt Nam. Vậy quả không hạt được tạo ra như thế nào? Các
nhà nhân giống trên tồn thế giới đang cớ gắng tạo ra giớng không hạt với cải
tiến, chất lượng và sức đề kháng bệnh tật. Về vấn đề này chúng tôi đã nghiên
cứu các loại cây ăn quả có múi ở địa phương như bưởi, cam, quýt… qua các
cách tiếp cận khác nhau, từ lai truyền thống, lai với công nghệ sinh học, quả
không hạt đã được được phát hiện với các đa bội cũng như các đa bội xảy ra
trong tự nhiên.
Bưởi, cam, quýt... là một trong những loại cây có giá trị kinh tế cao, nó
cung cấp nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể. Vỏ quýt giàu pectin

được sử dụng làm mứt, kẹo tinh dầu của chúng, còn được sử dụng nhiều trong
công nghệ thực phẩm, dược liệu và mỹ phẩm. Ở Việt Nam các giống được
trồng phổ biến ở nước ta như cam (Xã Đoài, Sông Con, Vân Du, Cam Sành),
bưởi (Phúc Trạch) và các giống nhiều hạt, tính trạng có hạt làm giảm giá trị
thương mại của công nghiệp quả có múi. Do vậy tạo giống cây ăn quả không
hạt là mục tiêu quan trọng của công tác giống. Điều này gây khó khăn trong
việc cạnh tranh ngày càng tăng và làm giảm chất lượng sản phẩm, cũng như
sự phổ biến của bưởi trong quốc tế các sản phẩm cùng loại được nhập khẩu từ
Trung Quốc, Thái Lan, Mỹ vì vậy tạo dòng tứ bội làm tặng chất lượng và tính
cạnh tranh cho sản phẩm. Trong các phương pháp gây đột biển đa bội đặc biệt
là tứ bội như gây chấn thương cơ giới, sốc nhiệt, tia rơn-gen thì phương pháp
hoá học đơn giản và nhanh nhất là sử lý các giống cây trồng nói chung các
loại cây có múi nói riêng với colchicine. Để tạo dòng tứ bội từ giống cây ăn
quả có múi địa phương.

1


1. Vật liệu và phương pháp
1.1. Vật liệu:
Các dòng bưởi Phúc Trạch, bưởi Diễn, bưởi Năm Roi, bưởi Đỏ tứ bội,
tam bội và nhị bội tạo được ở giai đoạn trước năm 2010. Các giống cam Vân
Du, Cam Xã Đoài đc, cam Sành, quýt tứ bội, tam bội và nhị bội tạo được ở
giai đoạn trước năm 2010. Các giống cam CT36 và giống quýt QST1 nhập
nội chọn được ở giai đoạn trước năm 2010.
1.2. Phương pháp:
Xử lý tạo ra sự đồng nhất trong phân chia tế bào ở chồi ngủ trước khi xử
lý cành bằng colchicin:
a/ Làm đứt rễ để kích thích ra rễ đờng nhất và kết quả là gây bật chời
mới đờng nhất.

b/ Cắt tồn bợ lá và chồi ngọn của các cành cây trước xử lý nhằm kích
thích q trình phân bào và bật chời ở chồi ngủ.
- Xác định trạng thái và mức độ nảy mầm của mắt chời ngủ bằng soi
kính hiển vi quang học.
- Cành đã được xử lý colchicin với các thời gian (0h;12; 24h; 48h; 72h)
và 7 nồng độ khác nhau (0; 0.05%; 0.1%; 0.2%; 0.3%; 0.4%; 0.5%), tổng số
35 công thức thí nghiệm ở mỗi giớng. Mỗi lơ thí nghiệm gồm 10 cây, mỗi cây
xử lý 1 cành, mỗi cành có nhiều chời nách được ngâm vào dung dịch.
- Pha dung dịch mẹ: Hoà tan 0.5g colchicine vào trong 100 ml nước cất
tạo dung dịch mẹ 0.5%. Dung dịch này để trong tới. Từ dung dịch mẹ pha
lỗng ra các nồng độ cần dùng: 0.05%; 0.1%; 0.2%; 0.3%; 0.4%; 0.5%. Dung
dịch hoạt động bề mặt Tween được bổ sung: 1 giọt Tween cho 50ml dung
dịch colchicine.
- Dung dịch colchicine được chứa trong một ống nhựa đen. Cành được
uốn cong, nhúng ngập trong dung dịch, sau đó dùng băng dính đen dán kín
miệng ống nhựa để tránh dung dịch bốc hơi. Sau thời gian thí nghiệm, cành
được rút ra khỏi ớng nhựa và được rửa sạch bằng nước sạch ba lần.
2


- Cành sau khi xử lý đã được quan sát để xác định ảnh hưởng của
colchicine lên các chỉ số phát triển cành: số cành bị chết, số cành sống sót, sớ
cành bật chời, thời gian từ xử lý đến bật chời, sớ chời có biến đợng hình thái
và sớ chời đa bợi hố.Các chời bật từ các mắt xử lý được đánh giá sự thay đởi
hình thái bằng mắt hoặc soi kính hiển vi.
- Lá và chời có thay đởi hình thái so với đới chứng được kiểm tra mức đa
bội thể bằng máy đo đa bội thể (Flow cytomertty analysis).
2. Các phương pháp khác tham khảo như:
Thí nghiệm in vivo này được tiến hành tại Đại học Sakhon Nakhon
Rajabhat, tỉnh Sakhon Nakhon, Thái Lan trong tháng 3 đến tháng 10 năm

2013. Nghiên cứu này nhằm tìm kiếm mợt số khả năng gây ra một số lượng
lớn các bộ tứ bội của nhiễm sắc thể ở trong cây cam qt với việc sử dụng
colchicine hóa học. Mợt thiết kế khới hồn tồn ngẫu nhiên (RCBD-A
Randomized Complete Block Design) với bốn lần nhân bản đã được sử dụng.
Hạt cam quýt được xử lý bằng dung dịch colchicine. Thí nghiệm gờm có 7
thực nghiệm.
-T1 với 0,0% colchicine (kiểm soát),
-T2 với dung dịch colchicine 0,2% và ngâm trong 12 giờ,
-T3 với dung dịch colchicine 0,2% và ngâm trong 24 giờ,
-T4 với dung dịch colchicine 0,4% và ngâm trong nước 12 giờ,
-T5 với dung dịch colchicine 0.4% và ngâm trong 24 giờ,
-T6 với dung dịch colchicine 0.8% và ngâm trong 12 giờ,
-T7 với dung dịch colchicine 0.8% và ngâm trong 24 giờ.
Thí nghiệm được tiến hành trong 91 ngày. Kết quả cho thấy rằng hợp
chất colchicine ảnh hưởng đáng kể đến sự nảy mầm của hạt cam quýt cam
quýt. Colchicine 0,2% trong dung dịch với hạt bị ngâm trong 24 giờ cho tỷ lệ
cao nhất của nhiễm sắc thể tứ bội trong cây giống cam quýt (63,64%).
Colchicine ảnh hưởng đáng kể đến sự nảy mầm của hạt, chiều cao cây, mật độ
khoang và chỉ số lá của hạt cam quýt và cây con. Colchicine khơng có ảnh
3


hưởng đáng kể đối với phôi đa-phôi, phôi đơn, số lá, diện tích lá, trọng lượng
lá, chiều dài lá và chiều dài khoang của cây cam quýt.
Một số hình ảnh tạo dòng tứ bội bằng xử lý colchicine ở cây ăn quả có
múi

Xử lý colchicine (cây trồng trong chậu và ngoài vườn ươm)
đặc điểm hình thái (lá, cành)
bưởi phúc trạch 2n và 4n


đặc điểm hình thái (lá,
cành) Cam Sành 2n và 4n

đặc điểm hình thái (lá,
cành) Cam Vân Du 2n và 4n

3. Kết quả và thảo luận:
Chúng tôi đã nhận thấy khi xử lý colchicine hàng loạt cành với các thời
gian và nồng độ colchicine khác nhau như đã mô tả kỹ trong phần phương
pháp. Các kết quả quan sát cho thấy:

4


- Sức sớng và mức đợ biến đởi hình thái của chồi phụ thuộc rất nhiều vào
nồng độ và thời gian xử lý colchicine.
- Với thời gian xử lý 12h ở nồng độ 0.05% và 0.1%: Khả năng bật mầm
và hình thái mầm khơng bị ảnh hưởng (so với đới chứng).
- Colchicine bắt đầu có biểu hiện ức chế đới với sự bật mầm của cây ở
nồng độ 0.05% trong thời gian 48 giờ. Khi nồng độ và thời gian xử lý tăng lên
thì tác động của colchicin tăng đối với mẫu xử lý (số cành bị chết tăng, số
cành sớng sót và sớ mắt bật chời giảm, thời gian từ xử lý đến bật chời tăng).
Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 1.
- Ở nờng đợ 0,05 % colchicine hầu như không có ảnh hưởng gì đến sức
sống của chồi ngay khi thời gian xử lý kéo dài đến 48 và 72 giờ. Khi tăng
nồng độ colchicine lên gấp hai lần ảnh hưởng của nó đã biểu hiện rõ ngay ở
thời gian xử lý 24 giờ. Khi nồng độ colchicin tăng lên 0,2% tỷ lệ nảy mần của
các giống giảm rất mạnh,ở nồng độ này với thời gian xử lý 24 giờ tỷ lệ sống
và nẩy mần của chồi ngủ ở các giống đều giảm xuống dưới 50%: Bưởi Phúc

Trạch 33%, Cam Sành 31%, Sông Con 30%, Vân Du 21%, Quýt Chum 22%.
- Liều lượng gây chết 100% có khác nhau đối với các giống khác nhau:
đối với Quýt Chum 100% mẫu xử lý chết ở nồng độ 0.3%, thời gian xử lý từ
24 đến 72h. Đối với Cam Vân du, Sông Con, Cam Sành, Bưởi Phúc Trạch
nồng độ gây chết 100% là 0.3%, thời gian xử lý từ 48 h.
Liều gây chết
Tên giống

100%
0.3%

Quýt Chum

Cam Vân Du

trong
0.1% trong 24h
trong

48h
0.3%

Sông con

- 70%

24h
0.3%

48h


Liều gây chết 50%

0.1% trong 48h
trong
0.1% trong 48h

5


0.3%
Cam Sành

48h
0.3%

Bưởi Phú Trạch

trong
0.2% trong 24h
trong

48h

0.1% trong 48h

- Cây bắt đầu có hiện tượng dị dạng ở lá và mầm quan sát thấy ở hầu hết
các giống ở nồng độ từ 0.1%, thời gian xử lý 24 giờ. Hiện tượng cành có
phiến lá dày hơn, bản lá rợng hơn quan sát thấy nhiều nhất ở nồng độ
colchicine 0,1%.

Cảm ứng khác nhau của các giống đối với các nồng độ và thời gian xử lý
colchicin khác nhau.
Chúng tôi cũng đã tiến hành xử lý các chồi non và đỉnh sinh trưởng của
các giống trên đây bằng cách nhúng trực tiếp chồi non vào colchicin trong
thời gian 12 giờ; 24 giờ ở nờng đợ 0.05% và 0.1% nhưng khơng có hiệu quả
vì các chồi non cảm ứng rất mạnh với colchicin và đều bị chết. Vì vậy phương
pháp của chúng tơi chỉ tiến hành được đối với các cành bánh tẻ chứa các mắt
ngủ.
4. Xác định các cành tứ bôi thể sau khi xử lý colchicin
Reuther và cộng sự (1968) đã mô tả các đặc trưng của các dịng tứ bợi
thể tạo được từ các giống chanh, cam, quýt, bưởi chùm và so sánh chúng với
các giống nhị bội thể tương ứng. Các đặc trưng khác biệt đó là:
- Số lượng nhiễm sắc thể của dịng tứ bợi tăng gấp đơi ở mỗi tế bào.
- Lá của dịng tứ bợi có phiến lá rộng hơn, tỷ lệ rộng/dài lớn hơn so với
giống nhị bội, phiến lá dày hơn, màu lá đậm hơn.
- Số lượng hạt của cây tứ bội thường ít hơn so với cây nhị bội.
Nghiên cứu của Frost (1926) mô tả các dạng tứ bội ở chanh, Hamill và
CS (1992) nghiên cứu ở chuối, Chakraborti và CS, (1998) nghiên cứu ở dâu
tằm cho thấy các cây đa bợi thường có trụ ngắn, xanh đậm, phiến lá dày và
rộng hơn ở các thể lưỡng bội tương ứng.

6


Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu trên đây chúng tơi đã tiến hành phân
tích các biến đởi hình thái của các cây sau xử lý. Các cành có lá dày hơn,
phiến lá rộng hơn đã được lấy mẫu lá để đo mức bội thể trên máy đo Flow
Cytometry. Kết quả đo mức bội thể cho thấy một số cây có lá dày, phiến lá
rợng ở 3 giớng bưởi Phúc Trạch, cam Vân Du, cam sành là tứ bội thể. Tuy
nhiên, nhiều tác giả cho biết hiện tượng khảm mức bội thể ở cây sau xử lý

colchicin là rất thường gặp (Reuther và CS, 1968). Cây khảm mức bội thể là
cây có các mức bợi thể khác nhau ở các tế bào, mô hoặc cơ quan khác nhau
trên cùng một cây. Qua quan sát bằng mắt kết hợp với đo mức bội thể đã phát
hiện thấy một số các cành có phiến lá dày hơn,bản lá rợng hơn đã được đa bợi
hố (tứ bợi = 4n) ở 3 giớng Bưởi Phúc trạch, Cam Vân Du, Cam Sành. Tất cả
các cây có biểu hiện đa bợi hoá đều nhận được ở nồng độ colchicine bằng
0,1%.Tổng số cây tứ bội thể nhận được ở các giớng thí nghiệm là19
cây.Trong đó 13 cây (81,2%) thu được ở nồng độ colchicine 0,1% và thời
gian xử lý 24 giờ, 5 cây thu được ở thời gian xử lý 48 giờ và 1 cây ở 72 giờ,
thời gian xử lý đạt hiệu quả cao nhất là 24 giờ. Tuy nhiên 13 cây trong số 19
cây là các cây khảm về mức bợi thể,chỉ có 3 cây trong số đó là thuần tứ bội
5. Phần kết luận:
Ưu điểm:
- Tạo dòng tứ bội từ giống cây ăn quả có múi địa phương bằng xử lý
colchicine:
- Tạo ra giống cây trồng có hiệu quả và năng suất cao.
- Nâng cao sự cạnh tranh trên thị trường quốc tế trong và ngoài nước, tạo
ra sản phẩm mới và được ưa chuộng
- Hiệu quả gây đột biến tạo ra các dạng biến dị đa bợi có chất lượng cây
tớt
- Các dịng tứ bợi này có thể dùng làm ngun liệu cho phát triển giống
mới.

7


Nhược điểm:
- Giá thành cây giống cao
- Thường các cây tự tứ bợi có khả năng kết hạt kém, hạt phấn ít, bởi vậy
sự tăng lên về trọng lượng hạt không bù đắp lại được sự tổn thất do số lượng

hạt bị giảm sút gây nên
- Cây tứ bội thường bất thụ.

8


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Internet:
/>of%20Colchicineinduced%20Autotetraploids%20in%20Pummelo%20(Citrus%20gran....pdf
/> />hon%20tao-CTP-CCN/18.pdf
và các gợi ý của thầy: Nguyễn Bá Nam

9